Nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát Trần Cúc Ánh Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Rực Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Lược sử nghiên cứu về nhiễm sắc thể người. Nghiên cứu cơ chế gây rối loạn nhiễm sắc thể người: rối loạn số lượng; rối loạn cấu trúc nhiễm sắc thể. Khái quát về tình hình nghiên cứu vô sinh và tình hình nghiên cứu nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát ở Việt Nam và trên thế giới. Trình bày và đánh giá các kết quả đạt được: Tuổi của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát; Nghề nghiệp của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát; Tần số rối loạn nhiễm sắc thể của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát; Các biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát. Keywords: Nhiễm sắc thể; Bệnh vô sinh nguyên phát; Rối loạn nhiễm sắc thể; Sinh học thực nghiệm Content MỞ ĐẦU Trong cuộc sống của mỗi con người, gia đình và con cái là nguồn hạnh phúc chính đáng và là động lực của sự trường tồn nòi giống. Khi một cặp vợ chồng không thể thực hiện được chức năng sinh sản thì họ phải đối mặt với nhiều áp lực của gia đình và xã hội. Chẩn đoán và điều trị ở những cặp vợ chồng hiếm muộn là vấn đề mang lại tính nhân văn rất lớn, mang lại hạnh phúc cho các cá nhân, gia đình và có ý nghĩa xã hội sâu sắc Hiện nay, do ảnh hưởng của các nhân tố như môi trường sống, dịch bệnh… nên tỷ lệ các cặp vợ chồng vô sinh ngày càng tăng. Trong các cặp vợ chồng thì ở người vợ có thể do tử cung bị dị dạng, u xơ tử cung; tử cung nhi tính, viêm lộ tuyến cổ tử cung…; ống dẫn trứng bị chít hẹp hay buồng trứng đa nang hoặc do các vấn đề nội tiết…; còn đối với người chồng có thể do tinh hoàn không xuống bìu hay viêm tinh hoàn, do bất thường hormon sinh dục… gây không có tinh trùng hoặc ít tinh trùng. Tuy nhiên một nguyên nhân quan trọng gây vô sinh cả ở người vợ và chồng đó là do rối loạn vật chất di truyền. Hiện nay trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu NST và những báo cáo về những cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát mang rối loạn số lượng và cấu trúc NST như mất đoạn, lặp đoạn, chuyển đoạn, đảo đoạn… Ở Việt Nam trong những năm gần đây đã có nhiều phòng xét nghiệm di truyền tế bào như Viện nhi Trung ương, Viện Sản Trung ương, phòng Di truyền tế bào bệnh viện Từ Dũ, phòng di truyền tế bào của bộ môn Y sinh học – Di truyền trường Đại học Y Hà Nội làm xét nghiệm và phân tích NST nhằm mục đích góp phần chẩn đoán những bệnh nhân mắc các bệnh liên quan đến rối loạn vật chất di truyền và để có phương pháp điều trị thích hợp để đưa ra những lời khuyên di truyền cho các bệnh nhân này. Vì vậy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bộ nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát Chƣơng 1- TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Lƣợc sử nghiên cứu về nhiễm sắc thể ngƣời Công trình của Tjio, J.H và Levan (1956) kết hợp xử lý nhược trương và colchicine đã công bố nghiên cứu xác định lại bộ NST 2n của người là 46 NST Năm 1960, Moorhead và cs công bố phương pháp làm tiêu bản NST từ lympho bào nuôi cấy ngắn hạn (48-72h) với việc dùng PHA (phytohemagglutinin) để kích thích phân bào. Từ đó chẩn đoán bệnh trên NST ngày càng được ứng dụng rộng rãi Từ năm 1970, với sự ra đời của các kỹ thuật nhuộm băng Q, băng G, băng R, băng C, băng T, N và nhuộm băng có độ phân giải cao NST, dùng BrdU (Bromodeoxyuridin) gắn vào ADN trên NST và nhuộm phân biệt chromatit chị em đã giúp các nhà nghiên cứu phát hiện các bất thường tinh tế đặc trưng trên từng NST ứng với các bệnh, tật, các hội chứng trong lâm sàng, phát hiện các rối loạn cấu trúc: mất đoạn, lặp đoạn, đảo đoạn và chyển đoạn… 1.2. Các cơ chế gây rối loạn nhiễm sắc thể ở ngƣời 1.2.1. Rối loạn số lượng *Đa bội thể Là hiện tượng tăng chẵn hoặc tăng lẻ cả bộ NST. Ví dụ: ở người 3n = 69 NST = thể tam bội (3n) thuộc dạng thể đa bội lẻ, 4n = 96 NST = thể tứ bội (4n) thuộc dạng thể đa bội chẵn. Cơ chế: - Thụ tinh của các giao tử bất thường - Sự phân chia bất thường của hợp tử - Sự thụ tinh kép hoặc xâm nhập của tế bào cực *Lệch bội: Là hiện tượng số lượng NST của tế bào tăng lên hoặc giảm đi một hoặc vài NST so với bộ NST lưỡng bội Cơ chế - Nhiễm sắc thể không phân ly trong giảm phân - Nhiễm sắc thể không phân ly trong quá trình phân cắt của hợp tử - Thất lạc nhiễm sắc thể 1.2.2. Rối loạn cấu trúc *Mất đoạn (Deletion) Là hiện tượng NST bị đứt rời ra một hoặc nhiều đoạn, đoạn bị đứt rời ra không có tâm sẽ tiêu biến đi hoặc gắn sang NST khác, phần còn lại mang tâm trở lên ngắn hơn bình thường. Có 2 kiểu mất đoạn: mất đoạn cuối và mất đoạn giữa. Một số trường hợp có biểu hiện chậm phát triển trí tuệ và rối loạn cơ quan sinh dục, hay gặp trong số đó là NST X hình vòng. Ví dụ: Hội chứng Turner: 46,Xr(Xq). * Chuyển đoạn (Translocation): Chuyển đoạn NST được xác định là hay gặp nhất trong rối loạn cấu trúc của NST. Có hai kiểu chuyển đoạn là chuyển đoạn tương hỗ (reciprocal translocation) và chuyển đoạn hòa hợp tâm (Robertsonian translocation). * Lặp đoạn (duplication) Là hiện tượng một đoạn nào đó của NST được nhân đôi lên. Lặp đoạn xảy ra khi 2 NST tương đồng ghép đôi với nhau không tương xứng trong kỳ đầu của phân bào giảm phân, có sự đứt của 2 NST và trao đổi đoạn giữa 2 đoạn khác nhau của 2 NST trong cặp tương đồng. Trong trường hợp này có 2 NST bị thay đổi cấu trúc, nhưng không mất đi hoặc tăng thêm vật liệu di truyền trong tế bào. * Đảo đoạn (invertion) Là sự bất thường cấu trúc do NST bị đứt ở hai điểm, đoạn giữa hai điểm đứt quay ngược 180 0 rồi nối lại, do đó một số gen bị đảo ngược thứ tự so với đoạn ban đầu. Có ba kiểu đảo đoạn: đảo đoạn ngoài tâm, đảo đoạn quanh tâm đối xứng, đảo đoạn quanh tâm không đối xứng. 1.3. Tình hình nghiên cứu vô sinh 1.3.1. Một số khái niệm - Vô sinh là tình trạng một cặp vợ chồng trong độ tuổi sinh đẻ có sức khỏe bình thường, mong muốn có con nhưng không thể có thai sau 12 tháng quan hệ tình dục mà không dùng biện pháp tránh thai nào. - Vô sinh nguyên phát (vô sinh I) là vô sinh mà người vợ chưa từng có thai lần nào. - Vô sinh thứ phát (vô sinh II) là vô sinh mà người vợ trước đây đã từng có thai, nhưng sau đó không thể có thai lại sau thời gian 1 năm. - Vô sinh nam giới là vô sinh mà nguyên nhân hoàn toàn do người chồng, người vợ hoàn toàn bình thường. - Vô sinh nữ giới là vô sinh mà nguyên nhân hoàn toàn do người vợ, người chồng hoàn toàn bình thường. 1.3.2. Nguyên nhân vô sinh do người vợ - Các nguyên nhân không do yếu tố di truyền: Do cổ tử cung; do tử cung và ống dẫn trứng; Do hội chứng đa nang buồng trứng; Do rối loạn rụng trứng; Do bệnh nội mạc tử cung; Các vấn đề nội tiết; do tuổi; nghề nghiệp… - Các nguyên nhân do yếu tổ di truyền: Mức độ tế bào: do bất thường về cấu trúc và số lượng nhiễm sắc thể, hay gặp là hội chứng Turner. Mức độ phân tử: hội chứng dứt gãy nhiễm sắc thể X, hội chứng Kallmann, hội chứng suy hạ đồi… 1.3.3. Nguyên nhân vô sinh do người chồng - Các nguyên nhân không do yếu tố di truyền: Tinh hoàn không xuống bìu, viêm tinh hoàn; giãn tĩnh mạch tinh, bất thường hormone sinh dục; tắc nghẽn đường sinh dục, do nhiễm khuẩn; Các vấn đề nội tiết; do tuổi; nghề nghiệp … - Nguyên nhân do yếu tố di truyền: Ở mức độ tế bào hay gặp nhất ở nam là hội chứng Klinefelter. Mức độ phân tử hay gặp nhất là mất đoạn nhỏ trên NST Y xảy ra ở ba vùng AZFa, AZFb, AZFc 1.4. Tình hình nghiên cứu nhiễm sắc thể của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát 1.4.1. Trên thế giới 1.4.2. Ở Việt Nam Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Từ tháng 6 năm 2010 đến tháng 6 năm 2012, tổng số 187 cặp vợ chồng (374 trường hợp) trong đó tuổi ở người vợ thấp nhất là 21 tuổi, cao nhất là 44 tuổi và tuổi của người chồng thấp nhất là 22 tuổi, cao nhất là 51 tuổi, được chẩn đoán lâm sàng là vô sinh nguyên phát từ các bệnh viện Phụ sản Trung ương, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Khoa sản bệnh viện Bạch Mai… đã gửi đến bộ môn Y sinh học – Di truyền, trường đại học Y Hà Nội yêu cầu xét nghiệm NST 2.1.1. Tiêu chuẩn chọn đối tượng - Các cặp vợ chồng kết hôn ít nhất trong vòng 1 năm (≥1 năm) mà chưa có con lần nào. - Có sức khỏe bình thường và rất mong muốn có con. - Quan hệ tình dục bình thường và không dùng biện pháp tránh thai nào. - Không tiếp xúc với các loại hóa chất (chất độc hóa học và các hóa chất bảo vệ thực vật…), các chất đồng vị phóng xạ… - Không nghiện rượu, thuốc lá. 2.1.2. Tiêu chuẩn loại trừ - Các cặp vợ chồng mắc các bệnh mãn tính (viêm gan siêu vi trùng, bệnh đái tháo đường…) và các bệnh nhiễm trùng đường sinh dục: ở người vợ (viêm lộ tuyến cổ tử cung, viêm tắc vòi trứng, tử cung dị dạng…); ở người chồng (viêm tinh hoàn, giãn tĩnh mạch tinh…) - Dị dạng về cơ quan sinh dục và tuyến sinh dục: ở người chồng như tinh hoàn không xuống bìu, tắc nghẽn ống sinh tinh bẩm sinh…; ở người vợ như tắc vòi trứng bẩm sinh, tử cung hai sừng, buồng trứng đa nang… - Các cặp vợ chồng thường xuyên tiếp xúc với các loại hóa chất độc hại, thuốc bảo vệ thực vật, các chất đồng vị phóng xạ… - Các cặp vợ chồng có vợ hoặc chồng hoặc cả hai nghiện rượu, thuốc lá… 2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Lập hồ sơ bệnh án di truyền 2.2.2. Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotyp - Nuôi cấy tế bào bạch cầu lympho máu ngoại vi theo phương pháp của Hungerford D.A. (1960). - Phương pháp nhuộm băng theo Seabright M (1971). - Phương pháp phân tích nhiễm sắc thể và lập karyotype: theo tiêu chuẩn ISCN (2005). 2.2.3. Xử lý số liệu Bằng chương trình Microsoft Excel 2007. Các ứng dụng: - Các hàm tính toán: SUM, AVERAGE, STDEV, MIN, MAX…. - Vẽ đồ thị và biểu đồ. Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Trong thời gian từ tháng 6/2010 đến tháng 6/2012, tổng số 187 cặp vợ chồng đã được khám lâm sàng tại bệnh viện Phụ sản Trung Ương, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, Khoa sản bệnh viện Bạch Mai… đã gửi đến bộ môn Y sinh học – Di truyền, trường Đại học Y Hà Nội yêu cầu xét nghiệm NST, phân tích và lập karyotyp, chúng tôi thu được kết quả như sau: 3.1. Tuổi của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát Tổng số 187 cặp vợ chồng (374 trường hợp) bị vô sinh nguyên phát. Trong đó: - Tuổi của người vợ thấp nhất là 21 tuổi, cao nhất là 44 tuổi, trung bình 29,78±5 - Tuổi của người chồng thấp nhất là 22 tuổi, cao nhất là 51 tuổi, trung bình 32,65±5,34 Nhìn chung các bệnh nhân trong nghiên cứu này phần lớn nằm trong độ tuổi mà khả năng sinh sản là cao nhất. 3.2. Nghề nghiệp của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát Trong tổng số 187 cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát đã được xét nghiệm, phân tích NST và lập karyotype bao gồm: cán bộ viên chức (CBVC), công nhân, làm ruộng, bộ đội, lao động tự do. Các cặp vợ chồng trong nghiên cứu của chúng tôi thuộc các nhóm nghề khác nhau nhưng nhìn chung đều không phải tiếp xúc với các chất đồng vị phóng xạ, các loại hóa chất độc hại, các thuốc bảo vệ thực vật. Những bệnh nhân này đã được chỉ định xét nghiệm di truyền để xác định xem họ có bị rối loạn ở mức độ NST hay không, mà những bất thường này có thể là nguyên nhân gây vô sinh ở các cặp vợ chồng. 3.3. Tần số rối loạn NST ở các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát Trong số 187 cặp vợ chồng (374 trường hợp) vô sinh nguyên phát được xét nghiệm NST, phân tích và lập karyotyp chúng tôi phát hiện có 41 cặp vợ chồng (vợ hoặc chồng) có biểu hiện rối loạn NST (chiếm tỷ lệ 10,96%), 146 cặp vợ chồng (chiếm tỷ lệ 89,04%) có karyotyp bình thường (46, XX hoặc 46, XY). 3.4. Tần số rối loạn NST giữa ngƣời vợ và ngƣời chồng ở các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát Tổng số 41 cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát có biểu hiện rối loạn NST (ở người vợ hoặc ở người chồng), trong đó chúng tôi phát hiện có 13 trường hợp người vợ (chiếm 3,48%) và 28 trường hợp người chồng (chiếm 7,48%). Như vậy tần số rối loạn nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát thường gặp ở người chồng hơn người vợ. 3.5. Các biểu hiện rối loạn NST ở các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát Khi phân tích NST của 187 cặp vợ chồng (374 trường hợp) chúng tôi phát hiện trong số 41 trường hợp mang rối loạn NST thì: 33 trường hợp (chiếm tỷ lệ cao 80,49%) có biểu hiện rối loạn NST giới tính gồm 25 trường hợp ở người chồng và 8 trường hợp ở người vợ. 8 trường hợp (chiếm tỷ lệ 19,51%) có biểu hiện rối loạn NST thường, bao gồm 3 trường hợp ở người chồng và 5 trường hợp ở người vợ. Như vậy rối loạn nhiễm sắc thể giới tính hay gặp hơn rối loạn nhiễm sắc thể thường. 3.5.1. Các biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể ở người vợ trong các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát 3.5.1.1. Các biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể giới tính ở người vợ 13 trường hợp rối loạn NST ở người vợ có 8 trường hợp rối loạn NST giới tính trong đó: Hội chứng Turner có 4 trường hợp bao gồm: 1 trường hợp thể thuần 45, X; 2 trường hợp thể khảm hai dòng tế bào karyotyp là 45, X [50]/46, XX [50]; 1 trường hợp thể khảm ba dòng tế bào có karyotyp là 45, X [50]/46, XX [30]/47, XXX [20]. 3 trường hợp là hội chứng 3 nhiễm sắc thể X đều ở thể khảm hai dòng tế bào karyotyp là 46, XX [60]/47, XXX và 1 trường hợp mang rối loạn cấu trúc kiểu chuyển đoạn tương hỗ giữa NST số 21 và NST X. có karyotyp là 46, XX, t(X;20)(q22;q13) Như vậy đa số các trường hợp rối loạn NST giới tính ở người vợ mà chúng tôi phát hiện được là rối loạn số lượng NST giới tính, tất cả đều là hội chứng Turner và hội chứng 3X, chỉ có 1 trường hợp mang rối loạn cấu trúc ở dạng chuyển đoạn 1.5.1.2. Các biểu hiện rối loạn NST thường ở người vợ 5 trường hợp rối loạn NST thường ở người vợ đều là rối loạn về cấu trúc NST, bao gồm: 2 trường hợp mang chuyển đoạn hòa hợp tâm giữa NST số 21 với NST số 21 và giữa NST số 13 với NST số 13 có karyotyp là 45, XX, t(21q; 21q) và 45, XX, t(13q;15q) 1 trường hợp mất đoạn nhánh dài NST số 16, karyotyp là 46,XX,del(16)(q22) 1 trường hợp lặp đoạn nhánh dài NST số 1, karyotyp 46,XX,dup(1)(q12) 1 trường hợp đảo đoạn NST số 12 có karyotyp là 46,XX,inv(12)(p13.q13) 1.5.2. Các biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể ở người chồng trong các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát 1.5.2.1. Các biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể giới tính ở người chồng Chúng tôi phát hiện được 25 trường hợp người chồng mang rối loạn nhiễm sắc thể, trong đó: 15 trường hợp hội chứng Klinefelter ở thể thuần 47, XXY 5 trường hợp hội chứng Klinefelter thể khảm với hai dòng tế bào 46, XY [50]/47, XXY [50] 2 trường hợp thể khảm hai dòng tế bào karyotyp là 45, X [5]/46, XY [95] 1 trường hợp hội chứng Klinefelter karyotyp là 47, XXY [80]/48, XXYY [20] 2 trường hợp mất nhánh dài NST Y có karyotyp là 46, XY, del (Y)(q11. 23); 46,XY, del(Y)(q11.2) Như vậy, trong các rối loạn nhiễm sắc thể giới tính ở người chồng thì hay gặp nhất là hội chứng Klinefelter thể thuần và thể khảm. 1.5.2.2. Các biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể thường ở người chồng Chúng tôi phát hiện được 3 trường hợp ở người chồng mang rối loạn NST thường bao gồm: 2 trường hợp chuyển đoạn hòa hợp tâm có karyotyp là: NST 45, XY, t(13q;15q); 45, XY, t(14q;21q) 1 trường hợp chuyển đoạn tương hỗ giữa NST số 1 và NST số 2 karyotyp là 46,XY, t(1;2)(p22;q21) KẾT LUẬN Kết luận 1. Trong tổng số 187 cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát chúng tôi phát hiện được 41 cặp vợ chồng (có vợ hoặc chồng) có biểu hiện rối loạn nhiễm sắc thể (chiếm tỷ lệ 10,96%) Kết luận 2. Trong số 41 trường hợp có rối loạn nhiễm sắc thể thì người chồng có 28 trường hợp (68,29%) và người vợ có 13 trường hợp (0,71%). Như vậy rối loạn nhiễm sắc thể ở các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát thường hay gặp ở người chồng hơn so với người vợ. Kết luận 3. Trong các rối loạn nhiễm sắc thể thì rối loạn nhiễm sắc thể giới tính có 33 trường hợp (người vợ hay gặp là hội chứng Turner, còn người chồng hay gặp là hội chứng Klinefelter) và 8 trường hợp rối loạn nhiễm sắc thể thường. Như vậy rối loạn nhiễm sắc thể giới tính hay gặp hơn rối loạn nhiễm sắc thể thường. KIẾN NGHỊ Kiến nghị 1. Việc xét nghiệm NST đối với những cặp vợ chồng vô sinh là cần thiết để phát hiện ra các rối loạn NST, tìm nguyên nhân vô sinh và tư vấn di truyền Kiến nghị 2. Những cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát không có biểu hiện rối NST nên phải xét nghiệm ở mức độ phân tử để phát hiện mất đoạn nhỏ (Microdeletion) trên NST X hoặc Y. References . các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát; Nghề nghiệp của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát; Tần số rối loạn nhiễm sắc thể của các cặp vợ chồng vô sinh nguyên. thể. Khái quát về tình hình nghiên cứu vô sinh và tình hình nghiên cứu nhiễm sắc thể ở những cặp vợ chồng vô sinh nguyên phát ở Việt Nam và trên thế giới.