Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế đánh giá khả sinh đáp ứng miễn dịch protein HA5.1 tái tổ hợp biểu Escherichia coli Trần Thị Nhài Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm; Mã số: 60 42 30 Ngƣời hƣớng dẫn: GS.TS Trƣơng Nam Hải Năm bảo vệ: 2012 Abstract: Tổng quan virus cúm biểu gen: cấu trúc khả gây bệnh virus cúm; Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh virus cúm A tế bào vật chủ; Cấu trúc, chức HA NA; Sự biến đổi kháng nguyên virus cúm A; Vaccine phòng cúm A/H5N1; Hệ biểu E coli; Chủng biểu E coli BL21; Vector biểu pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin Trình bày phƣơng pháp nghiên cứu biểu hiện, tinh chế đánh giá khả sinh đáp ứng miễn dịch protein HA5-1 tái tổ hợp biểu hiệu Escherichia Coli Đƣa kết thảo luận: thiết kế vector biểu PET22TRXHA5-1; biểu GEN HA5-1 chúng vi khuẩn E COLI BL21; lựa chọn điều kiện biểu protein tái tổ hợp TRXHA5-1 E COLI; tinh chế sơ protein tái tổ hợp TRXHA5-1; kiểm tra tính sinh đáp ứng miễn dịch protein tái tổ hợp HA5-1 Keywords: Miễn dịch; Virus cúm; Protein tái tổ hợp; Sinh học Content MỞ ĐẦU Cúm gia cầm thể độc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza - HPAI) dovirus cúm A/H5N1 gây bệnh truyền nhiễm cấp tính có tốc độ lây lan nhanh với tỷ lệ gây chết cao đàn gia cầm bị bệnh Virus cúm A/H5N1 phân type nhóm virus cúm A thuộc họ Orthomyxoviridae, có protein Hemagglutinin (HA) Neuraminidase (NA) bề mặt capsid hạt virus mang tính kháng nguyên tham gia trình đáp ứng miễn dịch Kháng nguyên HA có 16 type (ký hiệu từ H1 đến H16) kháng nguyên NA có type (ký hiệu từ N1 đến N9) Tính đến năm 2011 dịch cúm A/H5N1 xuất 50 quốc gia khác châu Á, châu Âu, châu Phi có nguy lan rộng khắp giới Theo thơng báo WHO, tính đến tháng 01/2012 có tới 583 trƣờng hợp mắc cúm A/H5N1, 344 trƣờng hợp tử vong, 120 triệu gia cầm chết nhiễm virus bị tiêu hủy Virus lây lan nhanh có độc lực cao vật chủ khác Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm virus cumsA/H5N1 bắt đầu xuất từ tháng cuối năm 2003 đầu năm 2004 nhanh chóng lan rộng hầu hết địa phƣơng nƣớc Hàng chục triệu gia cầm thuỷ cầm bị chết bị tiêu huỷ gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho ngành chăn ni Tiêm vaccine phịng virus cúm A/H5N1 cho gia cầm đƣợc coi cách phòng chống hiệu quả, đỡ tốn không ảnh hƣởng nguy hại tới môi trƣờng Xuất phát từ sở khoa học nhu cầu thực tế trên, tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện, tinh chế đánh giá khả sinh đáp ứng miễn dịch protein HA5-1 tái tổ hợp biểu Escherichia coli” Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan chung virus cúm 1.1.1 Một số đặc điểm về cấ u trúc c virus cúm Đặc tính cấu trúc chung tất nhóm virus họ Orthomyxoviridae hệ gen chúng chứa ribonucleic acid (RNA) sợi đơn âm, ký hiệu ss(-) RNA Các hạt virus cúm A (virion) có hình cầu hình khối đa diện, đƣờng kính 80 -120 nm, đơi có dạng hình sợi, khối lƣợng phân tử khoảng 250 triệu Da Vỏ virus với chất protein có ng̀n gốc từ màng tế bào nhiễm đƣợc đặc hiệu hóa để gắn protein màng virus vào , bao gồ m mô ̣t số protein đƣợc protein da ̣ng trầ n không đƣợc glycosyl hóa glycosyl hóa và mơ ̣t sớ Hình 1.1 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử (A), mơ hình (B) phức hợp ribonucleoprotein RNP (C) virus cúm A A: Các dạng hình thái khác virus cúm A dƣới kính hiển vi điện tử; B: Mơ hình cấu tạo hạt virus cúm A; C: Cấu trúc phức hợp ribonucleoprotein RNP (Nguồn: © Paul Digard, Dept Pathology, University of Cambridge) Hệ gen virus cúm A đƣợc cấu tạo từ đoạn đoạn riêng biệt (HA, NA, M, NS, NP, PA, PB1 PB2) nối với thành sợi bên vỏ virus, mã hóa cho 11 protein tƣơng ứng virus, phân đoạn M mã hóa cho protein M1 M2; phân đoạn NS mã hóa cho protein NS1 NS2, phân đoạn PB1 mã hóa cho protein PB1 PB1-F2 1.1.2 Cơ chế xâm nhiễm gây bệnh virus cúm A tế bào vật chủ Quá trình xâm nhiễm virus cúm A đƣợc mở đầu kết hợp HA thụ thể thích ứng bề mặt tế bào biểu mô cuối giải phóng hệ gen virus vào bào tƣơng tế bào nhiễm (Hình 1.2) Hình 1.2: Mơ hình chế xâm nhiễm nhân lên virus cúm A tế bào chủ 1.1.3 Cấu trúc, chức HA NA Protein HA (hemagglutinin) Protein hemagglutinin glycoprotein thuộc protein màng type I (lectin), có khả gây ngƣng kết hồng cầu gà ống nghiệm, kháng thể đặc hiệu với HA phong tỏa ngƣng kết đó, đƣợc gọi kháng thể ngăn trở ngƣng kết hồng cầu (HI- Hemagglutinin Inhibitory antibody) Protein NA (neuraminidase) Protein neuraminidase cịn gọi sialidase có chất glycoprotein đƣợc gắn bề mặt capsid virus cúm A, mang tính kháng nguyên đặc trƣng theo phân type NA Protein NA có vai trị enzyme cắt đứt liên kết gốc sialic acid màng tế bào nhiễm với phân tử cacbonhydrate protein HA q trình giải phóng hạt virus khỏi tế bào nhiễm ngăn cản tập hợp hạt virus màng tế bào 1.1.4 Sự biến đổi kháng nguyên virus cúm A Do kháng nguyên HA NA virus thƣờng xuyên biến đổi mà bệnh cúm khó kiểm sốt Có hai phƣơng thức chủ yếu làm biến đổi kháng nguyên virus cúm A Hiện tượng lệch kháng nguyên Lệch kháng nguyên (antigenic drift) thực chất đột biến điểm xảy phân đoạn gen/hệ gen virus virus cúm A khơng có chế “đọc sửa - proof reading” trình phiên mã chép nhân tế bào đích Hiện tượng trộn kháng nguyên Hiện tƣợng trộn kháng nguyên (còn gọi trao đổi hay tái tổ hợp) gen kháng nguyên virus cúm với gen khác số virus RNA gây bệnh gia cầm khác, cho phép virus có khả biến chủng cao 1.1.5 Vaccine phòng cúm A/H5N1 Đối với bệnh truyền nhiễm, vaccine đƣợc coi biện pháp có tính chiến lƣợc, nhằm ngăn chặn lây lan, tạo bảo hộ miễn dịch Hiện có loại vaccine đƣợc bán sử dụng rộng rãi Việt Nam là: Vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N2 (Trung Quốc: loại vaccine dị chủng; vaccine vô hoạt nhũ dầu H5N1 (Trung Quốc): loại vaccine đồng chủng; vaccine vô hoạt Nobilis Influenza H5 (Hà lan): loại vaccine dị chủng Hiện có sở nghiên cứu thử nghiệm loại vaccine virus phòng bệnh cúm gia cầm H5N1 cho ngƣời gia cầm nhƣ: + Công ty Vắc xin sinh phẩm số (VABIOTECH) Viện Vệ sinh & Dịch tễ Trung Ƣơng; + Viện Pasteur TP.HCM, + Viện Vaccine & Chế phẩm sinh học Nha Trang 1.2 BIỂU HIỆN GEN 1.2.1 Hệ biểu E coli Việc sử dụng rộng E coli dựa vào ƣu điểm bật là: thao tác vật liệu di truyền dễ, biểu protein ngoại lai lên đến 50% protein tổng tế bào, biểu lƣợng lớn protein ngoại lai tốc độ tăng trƣởng tế bào cao mật độ tế bào đủ lớn, môi trƣờng nuôi cấy đơn giản rẻ 1.2.2 Chủng biểu E coli BL21 Chủng biểu E coli BL21, gen lon protease (một protease nội bào) ompT protease (một protease định khu màng ngồi) bị đột biến Vì vậy, protein ngoại lai bị phân cắt protease tế bào chủ 1.2.3 Vector biểu pET22b(+) mang gen trx mã hóa cho Thioredoxin + Gen ngoại lai đƣợc điều khiển promotor T7 +Phiên mã đƣợc điều khiển lac operator, có chế cảm ứng IPTG + Sau vùng đa nối có đoạn trình tự mã hóa cho aa Histidin Ngồi Thioredoxin đƣợc biết: + Nhƣ tá chất làm tăng tính sinh miễn dịch kháng nguyên gây miễn dịch cho gia cầm + Giúp cho protein ngoại lai tránh bị phân cắt protease + Hình thành cấu trúc bậc xác Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU 2.1.1 Các chủng sinh vật plasmid - Chủng vi khuẩn E coli DH5α đƣợc sử dụng để tách dòng gen trxha5-1;Chủng vi khuẩn E coli BL21 đƣợc sử dụng để biểu gen ha5-1; Plasmid pET22b(+)mang gen trx; Plasmid pCR2.1 mang gen ha5-1 (pCRha5-l) 2.1.2 Hóa chất enzym * Hóa chất: SDS, Tris-HCl, EDTA (Serva, Đức); X-Gal (Sigma, Mỹ); phenol, metanol isoamylalcohol, EtBr, glyxerol, IPTG, etanol, chloroform (Roth, Đức); agan (Fluka, Đức); d-NTP (Promega, Mỹ); ampicillin (Merk, Đức); agaroza (Gibco, Mỹ); MgS0 (BioLabs, Anh) * Enzyme Các enzyme hạn chế (BioLab, Anh); Taq-DNA polymeraza (BioLabs, Anh); rionucleaza (Sigma, Mỹ); phosphataza kiềm, T4-DNA ligaza (BioLabs, Anh) 2.1.3 Máy móc thiết bị Máy PCR (MJ Research, Mỹ); máy ly tâm lạnh (Sorvall RC5B, Mỹ); máy ổn nhiệt (Mỹ); máy điện di, máy xác định DNA gel agaroza (Bio-Rad, Mỹ); máy lắc ổn nhiệt (New Jersey, Mỹ); máy ly tâm Eppendorf; Bộ tinh DNA từ gel agarose 2.1.4 Môi trƣờng nuôi cấy 2.1.4.1 Môi trƣờng dung dịch sử dụng biến nạp DNA plasmid vào tế bào E coli DH5α 2.1.4.2 Các dung dịch đƣợc sử dụng tách chiết DNA plasmid từ tế bào E coli DH5α 2.1.4.3 Các dung dịch đƣợc sử dụng điện di DNA gel agarose 2.1.4.4 Các dung dịch dùng điện di gel polyacrylamide-SDS 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1 Xử lý cắt DNA plasmid enzym cắt giới hạn 2.2.2 Phản ứng ghép nối gen ngoại lai vào plasmid 2.2.3 Biến nạp sản phẩm ghép gen vào tế bào E coli DH5α phƣơng pháp sốc nhiệt 2.2.4 Tách chiết plasmid DNA từ tế bào E coli 2.2.5 Điện di DNA gel agarose 2.2.6 Thu nhận băng DNA từ gel agarose 2.2.7 Điện di protein gel polyacrylamide 2.2.8 Biểu protein tái tổ hợp 2.2.9 Tinh sơ protein tái tổ hợp dung dịch đệm urê 2.2.10 Kiểm tra tính kháng nguyên TrxHA5-1 2.2.11 Kiểm tra khả sinh đáp ứng miễn dịch gà 2.2.11.1 Gây miễn dịch thu huyết gà 2.2.11.2 Phản ứng ngăn trở ngƣng kết hồng cầu (HI) Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN PET22TRXHA5-1 3.1.1 Chuyển gen ha5-1 vào vector biểu pET22trx Thu nhận đoạn gen ha5-1 từ plasmid pCRha5-1 mở vòng vector pET22Trx cặp enzym cắt giới hạn NcoI BamHI Sau nối đoạn gen ha5-1 vào vactor biểu pET22Trx để tạo nên vector tái tổ hợp pETTrxha5-1 pET22Trxha5-1 pET22Trx Hình 3.2: Phân tích sản phẩm tách chiết DNA plasmid gel agarose 0,8% 1-4: Plasmid tái tổ hơ ̣p pET22Trxha1; 5: Plasmid đố i chƣ́ng (pET22Trx) Kết điện di đờ cho thấy dịng plasmid đƣợc tách chiết (1,2,3,4) dòng plasmid tái tổ hợp pET22Trxha5-1 có kích thƣớc lớn kích thƣớc vector pEt22Trx 3.1.2 Kiểm tra plasmid tái tổ hợp pET22trxha5-l enzyme cắt giới hạn Cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp cặp enzyme cắt giới hạn NcoI BamHI Vector pET22trx đƣợc xử lý cặp enzyme để làm đối chứng M pET22Trx Ha5-1 5.9 kb kb Hình 3.3: Phân tích sản phẩm cắt kiểm tra plasmid tái tổ hợp (pET22Trxha5-1) enzym cắt giới hạn NcoI BamHI 1: plasmid pET22Trx (Đối chứng) ; 25: dòng plasmid tái tổ hợp; M: Thang ADN chuẩn 1Kb (Fermentas) Trên đƣờng chạy từ số đến số tƣơng ứng với sản phẩm cắt dòng plasmid tái tổ hợp xuất hai băng DNA có kích thƣớc tƣơng ứng khoảng kb 5,9 kb Dòng đối chứng cắt enzyme tạo đoạn DNA có kích thƣớc tƣơng đƣơng 5,9 kb nhƣ tính tốn lý thuyết 3.2 BIỂU HIỆN GEN HA5-1 TRONG CHỦNG VI KHUẨN E COLI BL21 Tế bào vi khuẩn E.coli mang plasmid tth đƣợc nuôi cấy cảm ứng với nồng độ IPTG 0,5mM 37oC Kết phân tích protein tổng số tế bào E coli tái tổ hợp cho thấy, đƣờng chạy số protein TrxHA5-1 đƣợc biểu với kích thƣớc khoảng 57,5 kDa nhƣ dự đốn Dịng đối chứng chủng E coli BL21 mang vector pET22Trx tổng hợp protein Trx có kích thƣớc 22 kDa kDa 116 66 45 35 TrxHA5-1 25 Trx 18.4 14,4 Hình 3.4: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E coli BL21; 1: Thang Protein chuẩn (Fermentas); 2: E coli BL21 mang vector pET22Trx; 3: E coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 3.3 LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN BIỂU HIỆN PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 TRONG E COLI 3.3.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến biểu gen ha5-l Chúng tiến hành nuôi cấy cảm ứng nhiệt độ 22°C, 28°C, 30°C, 37°C thu mẫu sau nuôi cấy cảm ứng TrxHA5-1 kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 Hình 3.6: Protein tổng số từ chủng tái tổ hợp E coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 đƣợc cảm ứng 0,5 mM IPTG nhiệt độ khác nhau; 1-4 : Nhiệt độ cảm ứng tƣơng ứng 22oC, 28oC, 30oC, 37oC; 5:Thang protein chuẩn 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ IPTG đến biểu gen ha5-l Khảo sát khả biểu protein TrxHA5-l nồng độ IPTG khác (0,1; 0,5; 1,0; 1,5; mM) TrxHA5-1 kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 Hình 3.7: Protein tổng số từ chủng E coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 đƣợc cảm ứng nồng độ IPTG khác nhau; 1-5 : Nồng độ chất cảm ứng IPTG tƣơng ứng 0,1mM, 0,5mM, mM, 1,5 mM: mM; 6: Thang protein chuẩn Nhƣ để đảm bảo thu đƣợc lƣợng lớn protein, đồng thời tiết kiệm chi phí sản xuất chúng tơi lựa chọn nờng độ IPTG 0,5 mM để biểu protein tái tổ hợp 3.3.3 Lựa chọn thời điểm thu mẫu thích hợp Thu tế bào theo thời gian để kiểm tra lƣợng TrxHA5-1 TrxHA5-1 kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 Hình 3.8: Protein tổng số từ chủng E.coli BL21 mang vector pET22Trxha5-1 đƣợc cảm ứng 0,5 mM IPTG thời gian thu mẫu khác nhau; 1-5 : Thời gian thu mẫu 1, 2, 3, 4, giờ; 6: Thang protein chuẩn Kết (Hình 3.8) cho thấy lƣợng protein thu đƣợc cao sau nuôi cấy cảm ứng 3.4 TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5-1 kDa 116 66 TrxHA5-1 45 35 25 18.4 14.4 Hình 3.9: Điện di kiểm tra Trxha5-1 tinh chế gel polyacrylamide; 1Protein tổng số E coli BL21 mang plasmid pETT22Trxha5-1;2-Thang protein chuẩn; 3: phân đoạn chứa Trx-HA5-1 hịa tan urê M Kết (Hình 3.9, đƣờng chạy 3) cho thấy protein tái tổ hợp thu đƣợc sau loại bỏ pha tan sạch, đƣợc thể băng protein có kích thƣớc khoảng 57,5 kDa đậm nhiều so với protein ban đầu Đối với protein tái tổ hợp sử dụng vaccine, điểm quan trọng phải có tính kháng ngun giống với tính kháng ngun protein tự nhiên Vì lý này, protein sau tinh chế đƣợc tiến hành thử khả đáp ứng đặc hiệu với kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 thu đƣợc từ thỏ kỹ thuật Western blot TrxHA5-1 kDa 116 66 45 35 25 18.4 14.4 kDa 116 66 TrxHA5-1 35 25 18.4 14.4 A B Hình 3.10: Kiểm tra tính kháng nguyên protein TrxHA5-1 tái tổ hợp; (A) Phân tích protein gel điện di polyacrylamide; (B): Phân tích khả bắt cặp đặc hiệu kháng nguyên tái tổ hợp với kháng thể kháng lại HA5 virus cúm A/H5N1; 1- phân đoạn chứa TrxHA51 sau tinh chế; - Thang protein chuẩn; - Protein tổng số E coli BL21 mang plasmid pETT22Trx đƣờng chạy số protein tổng Trên hình 3.10 (B) thấy số tách chiết từ chủng vi khuẩn E coli BL21 mang vector pET22trx không mang gen ha5-l, không thấy xuất băng màu có kích thƣớc tƣơng ứng với gen TrxHA5-l Trong đƣờng chạy số xuất băng protein rõ nét, kích thƣớc khoảng 57,5 kDa có khả kết hợp đặc hiệu với kháng thể kháng virus cúm A/H5N1 Điều chứng tỏ kháng nguyên tái tổ hợp TrxHA5-l đƣợc tổng hợp E coli với trình tự amino acid xác chứa định kháng nguyên nằm tiểu phần ha5-1 3.5 KIỂM TRA TÍNH SINH ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA PROTEIN TÁI TỔ HỢP HA51 Protein TrxHA5-1 sau tinh chế đƣợc trộn với tá chất Freund dùng để tiêm, tá chất Cbt dùng để nhỏ mũi (gà tuần tuổi) Lƣợng kháng nguyên TrxHA5-1 sử dụng để tiêm nhỏ mũi 100 µg Sau gây miễn dịch lần đƣợc 14 ngày, gà đƣợc gây miễn dịch lần Huyết gà sau tiêm nhỏ mũi, mắt đƣợc thu lại sau tuần tuần PBS Dịch lên men TrxHA5-1, tiêm chủng đối chứng TrxHA5-1, nhỏ mắt, mũi Hình 3.11: Khả sinh đáp ứng miễn dịch TrxHA5-1 gà Kết hình 3.11 cho thấy, lơ đƣợc gây miễn dịch với PBS không tạo kháng thể kháng lại TrxHA5-1, lô gà gây miễn dịch với chủng đối chứng, hiệu giá HI mức thấp Hiệu giá kháng thể gà đƣợc tiêm nhỏ mắt, mũi với TrxHA5-1 tăng dần từ tuần thứ đến tuần thứ đạt giá trị lớn sau 3, tuần, sang tuần thứ hiệu giá kháng thể lô tiêm giảm xuống nhanh lô nhỏ mắt, mũi hiệu giá có xu hƣớng giảm nhƣng trì mức cao so với lơ tiêm Nhƣ vậy, sơ thấy độ dài miễn dịch kháng nguyên đƣợc đƣa vào đƣờng nhỏ mắt, mũi tốt đƣờng tiêm KẾT LUẬN Với kết thu đƣợc trên, đến số kết luận sau: - Protein tái tổ hợp TrxHA5-l đƣợc biểu tốt tế bào E coli BL21 dƣới điều kiến promoter T7 chất cảm ứng IPTG có mơi trƣờng - Protein tái tổ hợp TrxHA5-l đƣợc tổng hợp tốt điều kiện lên men 30°C, 0,5 mM IPTG thời gian thu mẫu sau cảm ứng - Protein tái tổ hợp TrxHA5-l đƣợc tinh chế thành cơng siêu âm hịa tủa urê M - Protein tái tổ hợp đảm bảo tính kháng nguyên tính sinh miễn dịch gà Tuy nhiên hiệu giá kháng thể thu đƣợc sau gây miễn dịch với liều 100 g TrxHA5-1 thấp Hiệu giá tối đa thu đƣợc gây miễn dịch đƣờng tiêm 2,7 log2, gây miễn dịch qua đƣờng nhỏ mắt, mũi 2,2 log ĐỊNH HƢỚNG NGHIÊN CỨU Nghiên cứu liều vaccine thích hợp để thu đƣợc đáp ứng miễn dịch cao gà với hiệu giá HI ngang với vaccine thƣơng phẩm References Tiếng Việt Lê Thanh Hòa, Đinh Duy Kháng, Phan Văn Chi, Nông Văn Hải, Trƣơng Nam Hải, Nguyễn Thị Bích Nga Lê Trần Bình (2006), “Molecular characterization of the H5 gene for the highly pathogenic A/H5N1 strains isolated in Vietnam during”, 68-71 Proceedings of International Workshop on Biotechnology in Agriculture (20.10.2006) Nong Lam University Ho Chi Minh City Tiếng Anh Aoki F.Y., Boivin G., Roberts N (2007), “Influenza virus susceptibility and resistance to oseltamivir”, Antivir Ther 12(4B), PP 603-616, Review Baigent S J., McCauley J W (2001), “Glycosylation of haemagglutinin and stalk-length of neuraminidase combine to regulate the growth of avian influenza viruses in tissue culture”, Virus Res 79(1-2), PP 177-185 Basler C F (2007), “Influenza viruses: basic biology and potential drug targets”, Infect Disord Drug Targets 7(4), PP 282-293, Review Bender C., Hall H., Huang J., Klimov A., Cox N., Hay A., Gregory V., Cameron K., Lim W and Subbarao K (1999), “Characterization of the surface proteins of influenza A (H5N1) viruses isolated from humans in 1997 – 1998”, Virology 254, pp 115-123 Bosch F X., Garten W., Klenk H D., Rott R (1981), “Proteolytic cleavage of influenza virus hemagglutinins; primary structure of the connecting peptide between HA1 and HA2 determines proteolytic cleavability and pathogenicity of avian influenza viruses”, Virology 113, pp 725-735 Bublot M., Pritchard N., Swayne D E., Selleck P., Karaca K., Suarez D L., Audonnet J C., Mickle T R (2006), “Development and use of fowlpox vectored vaccines for avian influenza” Ann N Y Acad Sci, pp 193-201 Castrucci M R., Kawaoka Y (1993), “Biologic importance of neuraminidase stalk length in influenza A virus”, J Virol67, pp 759-764 Chen H., Deng G., Li Z., Tian G., Li Y., Jiao P (2004), “The evolution of H5N1 influenza viruses in ducks in southern China”, Proc Natl Acad Sci USA 101, pp 10452-10457 10 Chen L M., Davis C T., Zhou H., Cox N J., Donis R O (2008), “Genetic compatibility and virulence of reassortants derived from contemporary avian H5N1 and human H3N2 influenza A viruses” PLoS Pathog 4(5), e1000072 11 Conenello G.M., Zamarin D., Perrone L.A., Tumpey T., Palese P (2007), “A single mutation in the PB1-F2 of H5N1 (HK/97) and 1918 influenza A viruses contributes to increased virulence”, PLoS Pathog 3(10), pp 1414-1421 12 Doherty P C., Turner S J., Webby R G., Thomas P G (2006), “Influenza and the challenge for immunology”, Nat Immunol 7(5), pp 449-55, Review 13 Ellebedy A H., Webby R.J (2009), Influenza vaccines, Vaccine 27, D65-D68 14 Fouchier R A., Smith D J (2010), “Use of antigenic cartography in vaccine seed strain selection”, Avian diseases, PP 220-223 15.Glick B.R and Pasternak J.J (2003), Molecular Biotechnology, ASM Press, Washington DC 16 Hilleman M (2002), “Realities and enigmas of human viral influenza: pathogenesis, epidemiology and control”, Vaccine 20 (25-26), PP 3068-3087 17 Horimoto T., Kawaoka Y (2001) “Pandemic threat posed by avian influenza A viruses”, Clin Microbiol Rev 14(1), PP 129-149 18 Ito T., Couceiro J N., Kelm S., Baum L G., Krauss S., Castrucci M R., Donatelli I., Kida H., Paulson J C., Webster R G and Kawaoka Y (1998), “Molecular basis for the generation in pigs of influenza A viruses with pandemic potential”, J Virol 72, PP 73677373 19 Kamp B S., Hoffmann C., Preiser W (2006), Influenza report 20 Kash J.C., Goodman A.G., Korth M.J., Katze M.G (2006), “Hijacking of the host-cell response and translational control during influenza virus infection”, Virus Res 119(1), PP 111-120, Review 21 Keawcharoen J., Amonsin A., Oraveerakul K., Wattanodorn S., Papravasit T., Karnda S., Lekakul K., Pattanarangsan R., Noppornpanth S., Fouchier R A., Osterhaus A D., Payungporn S., Theamboonlers A and Poovorawan Y (2005), “Characterization of the hemagglutinin and neuraminidase genes of recent influenza virus isolates from different avian species in Thailand”, Acta Virol 49(4), PP 277-280 22 Li S., Liu C., Klimov A., Perdue M L., Mo D., Ji Y, Woods L., Hietala S., Bryant M (1999), "Recombinant influenza A virus vaccines for the pathogenic human A/Hong Kong/97 (H5N1) viruses", Infect Dis 179, PP 55-60 23 Macken C.A., Webby R.J., Bruno W.J (2006), “Genotype turnover by reassortment of replication complex genes from avian influenza A virus”, J Gen Virol 87(10), PP 28032815 24 Matrosovich M., Zhou N., Kawaoka Y., Webster R (1999), “The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties”, J Virol 73, PP 1146-1155 25 Murphy B R., Webster R G (1996), Orthomyxoviruses, In Fields BN, Knipe DM, Howley PM, (eds.), Fields Virology, 3rd ed, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, PP 13971445 26 Nayak D., Hui E., Barman S (2004), “Assembly and budding of influenza virus”, Virus Res 106(2), PP 147-165 27 Neumann G., Hatta M., Kawaoka Y (2003), “Reverse genetics for the control of avian influenza”, Avian disease 47, PP 882-887 28 Nicholson K G., Wood J M., Zambon M (2003), “Influenza” Lancet 362 (93970), PP 1733-1745 29 OIE - World organisation for animal health (2005), “Avian influenza Manual of diagnostic test and vaccines for terrestrial animals 30 Robertson B H., Bhown A.S., Compans R.W., and Bennett J C (1979), “Structure of the membrane protein of influenza virus Isolation and characterization of cyanogens bromide cleavage products”, J Viro, 30(3), PP 759-766 31 Suarez D L., Schultz-Cherry S (2000), “Immunology of avian influenza virus”, Dev Comp Immunol 24, PP 269-283 32 Subbarao K., Luke C (2007), “H5N1 viruses and vaccines” PLoS Pathog 3(3): e40, Review 33 Suzuki Y (2005), “Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host range variation of influenza viruses” Biol Pharm Bull 28(3), PP 399-408, Review 34 Treanor J.J., Campbell J.D., Zangwill K.M., Rowe Thomas and Wolff Mark (2006), “Safety and Immunogenicity of anInactivated Subvirion Influenza A (H5N1) Vaccine” ,NEJM, PP 1343-1351 35 Uiprasertkul M., Kitphati R., Puthavathana P., Kriwong R., Kongchanagul A., Ungchusak K., Angkasekwinai S., Chokephaibulkit K., Srisook K., Vanprapar N, Auewarakul P (2007), “Apoptosis and pathogenesis of avian influenza A (H5N1) virus in humans”, Emerg Infect Dis 13(5), PP 708-712 36 Wagner R., Matrosovich M., Klenk H (2002), “Functional balance between haemagglutinin and neuraminidase in influenza virus infections ”, Med Virol 12(3), PP 159-166 37 Weber T P., Stilianakis N I (2007), “Ecologic immunology of avian influenza (H5N1) in migratory birds”, Emerg Infect Dis 13(8), PP 1139-1143, Review 38 Webster R G (1998), “Influenza: an emerging disease”, Emerg Infect Dis 4, PP 436441 39 Webster R.G., Guan Y., Peiris M., Walker D., Krauss S., Zhou N N., Govorkova E A., Ellis T M., Dyrting K C., Sit T., Perez D.R., Shortridge K.F (2002), “Characterization of H5N1 influenza viruses that continue to circulate in geese in southeastern China”, J Virol 76(1), PP 118-126 40 Weiss R.A (2003), Cross-species infections Curr Top Microbiol Immunol 278, PP 4771 41 WHO (2005), “Avian influenza A (H5N1) infection in humans”, NEJM, 1374 42 Wu C., Cheng X., He J., Wang J., Deng R., Long Q., Wang X (2008), “A multiplex realtime RT-PCR for detection and identification of influenza virus types A and B and subtypes H5 and N1”, J Virol Methods 148(1-2), PP 81-88 43 Yamada S., Suzuki Y., Suzuki T., Le M Q., Nidom C A., Sakai-Tagawa Y., Muramoto Y., Ito M., Kiso M., Horimoto T., Shinya K., Sawada T., Kiso M., Usui T., Murata T., Lin Y., Hay A., Haire L F., Stevens D J., Russell R J., Gamblin S J., Skehel J J., Kawaoka Y (2006), “Haemagglutinin mutations responsible for the binding of H5N1 influenza A viruses to human-type receptors”, Nature 444(7117), PP 378-382 44 Zhou J J., Fu J., Fang D Y., Yan H J., Tian J., Zhou J M., Tao J P., Liang Y., Jiang L F (2007), “Molecular characterization of the surface glycoprotein genes of an H5N1 influenza virus isolated from a human in Guangdong, China”, Arch Virol 152(8), 15151521  ... cứu biểu hiện, tinh chế đánh giá khả sinh đáp ứng miễn dịch protein HA5- 1 tái tổ hợp biểu Escherichia coli? ?? Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1 Tổng quan chung virus cúm 1. 1 .1 Một số đặc điểm về... cảm ứng 3.4 TINH CHẾ SƠ BỘ PROTEIN TÁI TỔ HỢP TRXHA5 -1 kDa 11 6 66 TrxHA5 -1 45 35 25 18 .4 14 .4 Hình 3.9: Điện di kiểm tra Trxha5 -1 tinh chế gel polyacrylamide; 1Protein tổng số E coli BL 21 mang... di protein gel polyacrylamide 2.2.8 Biểu protein tái tổ hợp 2.2.9 Tinh sơ protein tái tổ hợp dung dịch đệm urê 2.2 .10 Kiểm tra tính kháng nguyên TrxHA5 -1 2.2 .11 Kiểm tra khả sinh đáp ứng miễn dịch