Mức độ nhiễm vi nấm sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê ở một số vùng trồng cà phê trọng điểm Lý Thu Hương Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Luận văn ThS. ngành: Vi sinh vật học; Mã số: 60 42 40 Người hướng dẫn: PGS.TS. Kiều Hữu Ảnh Năm bảo vệ: 2012 Abstract. Khảo sát sự nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê. Phân lập và phân loại chủng nấm mốc A.niger và P.viridicatum trong đất và rễ cây cà phê. Xác định khả năng sinh ochratoxin A của các chủng nấm mốc A.niger và P.viridicatum nhiễm trong đất và rễ cây cà phê. Keywords. Vi sinh vật học; Vi nấm; Cây cà phê; Đất; Nấm mốc Content MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề Cà phê là một trong những sản phẩm nông nghiệp chính có giá trị kinh tế cao của nước ta. Cà phê là nông sản được xuất khẩu với số lượng lớn sang các nước thuộc khối ASEAN, Nhật Bản, Cộng hoà liên bang Nga và một số nước Đông Âu. Vì vậy, việc nâng cao chất lượng cà phê nói riêng và các nông sản nói chung bao gồm các kỹ thuật bảo hiểm trên nông sản đồng thời chế biến chúng thành những sản phẩm có giá trị dinh dưỡng bảo quản giữ gìn các giá trị dinh dưỡng, ngăn cản các chất độc hại cao đang ngày càng được quan tâm. Nước ta là nước nhiệt đới có khí hậu nóng ẩm, rất thuận lợi cho nấm mốc phát triển. Hàng năm, những tổn thất về lượng và chất của cà phê và các nông sản khác do nấm mốc gây ra chiếm một phần đáng kể. Nguyên nhân nhiễm nấm mốc trên nông sản là do nấm mốc trong đất đã nhiễm vào rễ của cây rồi từ đó nhiễm nội sinh vào cây trồng, tiếp đó có thể nhiễm vào trong hạt. Nấm mốc phát triển trên hạt, sử dụng dinh dưỡng của hạt như protein, hydrocacbon, vitamin,…Đặc biệt, rất nhiều loài nấm mốc trong quá trình phát triển đã tạo ra các độc tố ảnh hưởng nguy hiểm tới sức khỏe con người và động vật kinh tế. Ochratoxin A là độc tố đầu tiên được phát hiện sau độc tố aflatoxin và là một trong những độc tố nguy hiểm nhất thường nhiễm trên cà phê. Ochratoxin A gây suy giảm hệ miễn dịch, ảnh hưởng đến hệ thần kinh, gây tổn thương cấp và mãn tính cho thận, ung thư thận và có thể gây quái thai,… Hiện nay, trên thế giới, việc nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc sinh độc tố trên lương thực thực phẩm và các biện pháp phòng chống đã được coi là một vấn đề quan trọng. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và Tổ chức Nông Lương thế giới (FAO) cũng như Bộ Nông nghiệp, Bộ Y Tế của nhiều nước đã đưa ra những chương trình khuyến cáo về độc tố nấm mốc và xây dựng tiêu chuẩn về giới hạn cho phép của độc tố nấm mốc trên lương thực. Ở nước ta, vấn đề nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc sinh độc tố trên lương thực thực phẩm và các biện pháp phòng chống độc tố nấm mốc đang ngày càng được quan tâm. Tuy nhiên, việc nghiên cứu mức nhiễm nấm mốc sinh độc tố ochratoxin A trên cây cà phê và các nông sản khác thì còn rất mới mẻ. Xuất phát từ đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “ Mức độ nhiễm vi nấm sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê ở một số vùng trọng điểm trồng cà phê ” 1.2. Mục tiêu và nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục tiêu Xác định được mức độ nhiễm nấm mốc sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê ở một số vùng trọng điểm trồng cà phê ở Việt Nam. 1.2.2. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát sự nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê. - Phân lập và phân loại chủng nấm mốc A.niger và P.viridicatum trong đất và rễ cây cà phê. - Xác định khả năng sinh ochratoxin A của các chủng nấm mốc A.niger và P.viridicatum nhiễm trong đất và rễ cây cà phê. Chƣơng 1: TỔNG QUAN 1.1. Hệ nấm mốc trên lƣơng thực 1.1.1. Hệ nấm mốc ngoài đồng Các hạt lương thực hay hạt giống trước khi thu hoạch có thể bị nấm mốc xâm nhiễm. Các nấm mốc ngoài đồng được phân biệt theo các loại ngũ cốc, vùng, địa lý cư trú, thời tiết,… Một số loại nấm mốc ngoài đồng điển hình là Alternaria, Cladosporium, Helminthosporium, và Fusarium. Tất cả các nấm mốc ngoài đồng có thể sống qua được trong nhiều năm ở hạt khô. Các nấm mốc ngoài đồng có thể ảnh hưởng tới bề ngoài và chất lượng của hạt. Thông thường, tổn thất gây nên do nấm mốc ngoài đồng xảy ra trước khi thu hoạch có thể phát hiện ra bằng phương pháp giám định thông thường và không tiếp tục tăng lên trong quá trình bảo quản. Điều này được nhận biết rõ nhất là bắp, khi chín khô ngoài đồng, chưa thu hoạch kịp, gặp mưa có độ ẩm cao, các loại nấm mốc có nguồn gốc từ đất tấn công vào nông sản. Muốn khắc phục tình trạng này cần phải thu hoạch kịp thời, không nên để lâu ngoài đồng. Sau khi thu hoạch phải phơi sấy ngay cho khô đến khi độ ẩm còn 13% mới đem bảo quản. 1.1.2. Hệ nấm mốc bảo quản Các nấm mốc bảo quản thường thấy ở trên các nguyên liệu có nguồn gốc hữu cơ và vô cơ đa dạng, đặc biệt trên các rau quả thối rữa, các sản phẩm thực phẩm. Chúng nhiễm trên các hạt lương thực và hạt giống sau khi thu hoạch. Nguyên nhân chủ yếu là do độ ẩm trong thức ăn còn cao (> 14%) đã đem dự trữ hoặc do độ ẩm không khí trong kho cao hấp thu trở lại vào nguyên liệu, do chênh lệch nhiệt độ ngày đêm làm cho nước ngưng tụ trên bề mặt lớp thức ăn gây ra hiện tượng ẩm cục bộ, tạo điều kiện tốt cho nấm phát triển. Theo nghiên cứu của Christensen [9] hệ nấm mốc bảo quản gồm mười hai loài Aspergillus, (trong đó chỉ năm loài là phổ biến), một số loài Penicillium, các loài của Sporendonema,… Các loài nấm mốc bảo quản có khả năng phát triển ở các hạt lương thực có hàm ẩm cao, từ 70%- 90%. Các nấm mốc bảo quản phát triển nhanh trên hạt ở khoảng 30º- 32ºC. Tốc độ phát triển của chúng giảm khi nhiệt độ giảm. Muốn khắc phục tình trạng này phải thường xuyên hút ẩm thông thoáng trong kho. 1.2. Đại cƣơng về độc tố nấm mốc Độc tố nấm mốc (mycotoxin) là nhóm hợp chất có cấu trúc đa dạng, có khối lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bằng trao đổi thứ cấp của các nấm mốc và gây độc đối với động vật có vú, cá và gia cầm [20]. Sự sản sinh độc tố nấm mốc là kết quả của tác động qua lại giữa kiểu gen và điều kiện phát triển của chúng. Sự sinh trưởng, phát triển của độc tố nấm mốc phụ thuộc rất nhiều vào điều kiện sinh thái như vùng, khí hậu, nhiệt độ, độ ẩm của cơ chất,… Từ năm 1960, bệnh độc tố nấm mốc đã bắt đầu được nghiên cứu sâu. Vào năm 1960, ở nước Anh người ta đã phát hiện bệnh X trên gà tây đã làm chết hàng vạn con gà. Nguyên nhân là chúng đã ăn phải lạc bị nhiễm độc tố nấm mốc. Nghiên cứu về các động vật thực nghiệm cho thấy tính độc của các mycotoxin là rất lớn. [7] Nấm mốc có thể phát triển và sinh độc tố trên cơ chất là hầu hết các sản phẩm thực vật do đó nó tạo khả năng nhiễm trực tiếp độc tố vào thực phẩm của con người. Khi ăn các thức ăn có nhiễm độc tố, vật nuôi không chỉ chịu tác dụng độc trực tiếp mà còn là nguồn mang độc tố vào sữa, thịt, và như vậy tạo sự nhiễm độc tố tiếp theo cho con người. Thường thì con người và vật nuôi bị nhiễm độc tố nấm mốc khi ăn phải lương thực, thực phẩm bị nhiễm độc tố.[2] Hiện nay có khoảng 300 loại độc tố được phát hiện và nghiên cứu. Tuy nhiên chỉ có khoảng 20 loại độc tố có trong thực phẩm ở mức độ nghiêm trọng và liên quan đến an toàn thực phẩm. Được tạo bởi năm chi nấm là Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria và Claviceps, chúng bao gồm: Các độc tố của Aspergillus: Aflatoxin ( B 1 , B 2 , G 1 , G 2 , M 1 , M 2 ), ochratoxin A, stermatocystin, axit cyclopianxoic. Các độc tố của Penicillium: Pautulin, ochratoxin A, citrinin, penitrem A và axit cyclopianzoic toxin, fumonisin, moniliformin, diacetocyscirpenon. Các độc tố của Fusarium: deoxynivalenon, nivalenon, zearalenon, T-2 toxin. Các độc tố của Alternaria: Axit tenuazoic, alternarion, methyl ether alternarion. Các độc tố của Claviceps: Các alkaloid của nấm cựa gà [45] Độc tố nấm mốc ngày càng thu hút sự quan tâm, nghiên cứu của các nhà khoa học ở nhiều lĩnh vực khác nhau. Rất nhiều hội nghị quốc tế, hội thảo, chuyên khảo, tạp chí và các bài báo nghiên cứu về vấn đề có tính cấp thiết này. Những giải pháp phòng trừ Mycotoxin: - Nên chọn nguyên liệu mới làm thức ăn chăn nuôi. - Thường xuyên kiểm tra nguyên liệu trước, trong khi dự trữ và lúc sử dụng để trộn thức ăn cho thú. - Kiểm tra, khống chế độ ẩm và nhiệt độ thích hợp trong quá trình dự trữ nguyên liệu. - Bảo quản nguyên liệu nơi khô ráo. - Kiểm soát và trừ khử côn trùng, sâu mọt, chuột trong kho: côn trùng hô hấp đốt chất dinh dưỡng sinh ra H 2 O làm ẩm nguyên liệu giúp nấm mốc phát triển đồng thời khi di chuyển chúng đã mang theo bào tử nấm phát tán nhanh trong kho. - Sử dụng hóa chất chống nấm mốc: có nhiều chất hóa học khác nhau có thể khống chế sự nhiễm nấm mốc trong thức ăn, hiện nay có thể nói chất tương đối an toàn không độc hại và có hiệu lực cao ngăn chặn sự phát triển nấm mốc trong thức ăn là acid propionic và các muối của nó - Vô hiệu hóa độc lực mycotoxin bằng phương pháp vật lý và hóa học: ngoài các biện pháp như xử lý nhiệt, ánh sáng, sử dụng ozone để oxi hóa mycotoxin và sử dụng chất kiềm NH 3 thì việc sử dụng chất hấp phụ bề mặt các lọai mycotoxin xem ra có hiệu quả cao và ít chi phí nhất hiện nay. + Các loại đất sét: bentonite, zeolite và aluminosilicate, có nhiều kết quả đã được kiểm chứng chỉ ra rằng các lọai đất sét kể trên đặc biệt là Hydrate sodium calcium aluminosilicate (HSCAS) là có hiệu quả nhất với hàm lượng 10kg/tấn có thể lọai bỏ được các tác hại của aflatoxin ở gà, heo và bò. Tuy nhiên, các lọai này vẫn còn 1 số khuyết điểm như hàm lượng sử dụng cao, hiệu quả kết dính trong phạm vi hẹp và chỉ có hiệu lực chủ yếu với aflatoxin còn các độc tố khác ít có hoặc không có hiệu quả. + Các chất kết dính hữu cơ mà đại diện là EGC (Esther Glucomannan) là thế hệ chất hấp phụ độc tố nấm mốc có nhiều thành quả nhất đáp ứng được hầu hết các yêu cầu về một chất hấp phụ độc tố điều mà các loại đất sét còn thiếu sót. 1.3. Ochratoxin 1.3.1. Các loại độc tố ochratoxin Sau aflatoxin thì ochratoxin là nhóm độc tố tiếp theo được phát hiện. Hiện nay có 4 loại ochratoxin được biết đến là ochratoxin A, ochratoxin B, ochratoxin C (este etyl của ochratoxin A) và este metyl của ochratoxin A. Ở các ochratoxin chủ yếu là sự ghép một nhân phenylalanine và một nhân izocumarin. [6] Công thức cấu tạo của độc tố ochratoxin A như sau: Ochratoxin A Claude Moneau và cộng sự [5] khi nghiên cứu tính chất hoá lý của ochratoxin đã đưa ra những kết quả sau: Bảng 1.1: Tính chất hoá lý của các ochratoxin Ochratoxin Công thức phân tử Trọng lƣợng phân tử (MW) Điểm nóng chảy (ºC ) Ochratoxin A C 20 H 18 O 6 NCl 417 105-110 Ochratoxin B C 20 H 19 O 6 N 369,15 221 Ochratoxin C (este etyl của ochratox in A ) C 22 H 22 O 6 NCl 431 Este metyl của ochratoxin A C 21 H 20 O 6 NCl 417,5 1.3.2. Tính chất hoá lý của độc tố ochratoxin Hợp chất đầu tiên được phát hiện trong nhóm độc tố ochratoxin là ochratoxin A, được phân lập từ Aspergillus ochraceus. Ochratoxin A là tinh thể không màu, phát quang màu xanh dưới ánh sáng cực tím. Muối natri của ochratoxin A hoà tan trong nước, hoà tan nhẹ ở các dung môi phân cực như clorofom, methanol, Ochratoxin A tinh khiết bền ở nhiệt độ cao. Ochratoxin A ít hoặc không bị phá huỷ ở điều kiện nấu bình thường. Tuy nhiên ochratoxin A bị phân huỷ dưới tác dụng trực tiếp của ánh sáng mặt trời. Trong quá trình thuỷ phân axit ochratoxin A sẽ tạo ra phenylalanine và axit lacton hoạt động về mặt quang học. Ochratoxin C là chất trao đổi tìm thấy ở nước tiểu của động vật ăn thức ăn có nhiễm ochratoxin A. [6] 1.3.3. Sự tạo độc tố ochratoxin A do các nấm mốc Ochratoxin A đầu tiên được phân lập từ Aspergillus ochraceus nhưng những nghiên cứu tiếp theo cho thấy các biến chủng của chi Aspergillus và Penicillium cũng tạo ochratoxin A. Các nấm mốc tạo ochratoxin A ở chi Aspergillus gồm: A.ochraceus, A. elegans, A.fresenii, A.melleus, A.ostianus, A.petrakii, A.screrotium, A.sulphureus. Các nấm mốc tạo ochratoxin A ở chi Penicillium gồm: P.verrucosum, P.viridicatum, P.chrysogenum, P.commune và P.cyclopium, P.expansum, P.palitans, P.purpurescence, P.nordiceum, P.variable.[4] Ochratoxin A được tạo ở nhiệt độ tối thích từ 20º- 30ºC và hoạt độ nước 0,953 (39% hàm lượng nước tính theo phần trăm trọng lượng khô), ở nhiệt độ cao hơn hàm ẩm yêu cầu cao hơn a w = 0,997 hay 52% ẩm. Các nấm Penicillium thường tạo ochratoxin A trong điều kiện nhiệt độ thấp còn các nấm Aspergillus thường tạo ochratoxin A ở nhiệt độ cao hơn. [1] 1.3.4. Độc tính của ochratoxin A Tác dụng độc đầu tiên của ochratoxin A là ức chế sinh tổng hợp protein. Tác dụng là đặc trưng và bao gồm ức chế cạnh tranh của sự tổng hợp phenylalanin tRNA Phe . Thận là cơ quan nhạy cảm nhất đối với ochratoxin A. Ochratoxin A có thể gây ra tổn thương cấp tính cũng như mãn tính cho thận. Ochratoxin A tác động lên hệ miễn dịch, làm suy giảm hệ thống miễn dịch và có khả năng gây quái thai. Ochratoxin A còn là một trong những chất gây ung thư. Những kết quả nghiên cứu cho thấy, việc cho uống ochratoxin A trong thời gian 2 năm ở các liều từ 3500 đến 6000 ng/kg trọng lượng cơ thể/ngày ở chuột cái và 70 ng/kg trọng lượng cơ thể/ngày ở chuột đực đã kích thích tạo các u, trước hết là các u thận. Bệnh thận địa phương của vùng Balkan (BEN), chẳng hạn như vùng Vratza của Bulgari là một bệnh nghiêm trọng. Bằng chứng đã rõ là với cách bảo quản truyền thống đã khiến lương thực thực phẩm ở các địa phương này bị nhiễm các nấm mốc sinh độc tố ochratoxin A [6]. Những nghiên cứu của Claude Moneau và cộng sự đã cho thấy độc tính của ochratoxin A là nguy hiểm nhất trong các ochratoxin. Ochratoxin A làm giảm sản lượng trứng, sữa, giảm chất lượng vỏ trứng, ảnh hưởng đến thận của các loại gia cầm. Chó, mèo, lợn, gà, gà tây, vịt con rất nhạy cảm với loại độc tố này. LD 50 của ochratoxin A đối với vịt con là 135- 170n/con. Nghiên cứu cho thấy ở lợn với hàm lượng nhiễm ochratoxin A 200 ppb làm giảm tăng trọng, gây tổn thương thận nhẹ. Theo nghiên cứu của Osweiler (1992) [44] thì liều gây chết gia súc trong vòng 5 đến 6 ngày là 1mg/1kg thể trọng. Còn ở gà mái Leghorn (Lơgo) trắng tuổi từ 14 tuần đến một năm ochratoxin A gây chậm thành thục sinh dục và đẻ ít trứng (với nồng độ thấp), gây đẻ ít trứng rõ rệt, rối loạn gan và thận, đôi khi làm chết gà (ở nồng độ cao).[49] Bằng thực nghiệm người ta đã nhiễm độc cho vịt con và chuột, kết quả nhận thấy vịt và chuột bị viêm ruột, rối loạn thận, hoại tử ở tiểu quản thận, rối loạn gan, hoại tử các tế bào quanh cửa gan, thông thường nhiễm vào các tế bào riêng lẻ. Ochratoxin A và dihidro- izocumarin, một trong những sản phẩm thuỷ phân của nó gây ức chế nghiêm trọng sự hô hấp nhịp khi cho hai chất đó ở nồng độ thấp vào các thể ty lạp riêng rẽ ở gan chuột. Ochratoxin A còn gây sẩy thai ở động vật thí nghiệm và ở các động vật trong các trại chăn nuôi. Giá trị LD 50 (liều gây chết tối thiểu 50% số động vật thí nghiệm) của ochratoxin A đối với một số động vật được thể hiện qua bảng 1.2 dưới đây. Bảng 1.2: LD 50 của ochratoxin A đối với một số loài động vật [24] Loài LD 50 (mg/kg trọng lƣợng cơ thể) Trong miệng Trong màng bụng Trong tĩnh mạch Chuột mới sinh 3,9 Chuột 46 - 58 22 - 40 26 - 34 Chó 0,2 Lợn 1 Gà 3,3 1.3.5. Phƣơng pháp phân tích Phương pháp phân tích ochratoxin A gồm các bước: chiết xuất, làm sạch chất chiết, định tính và định lượng. Chiết xuất: Sử dụng hệ dung môi phù hợp để chiết được chọn lọc ochratoxin A cần phân tích. Làm sạch: Làm sạch bằng kỹ thuật vi cột ( sep- pack cartridge ). Sep- pak cartridge là vi cột được nhồi 16 chất hấp phụ cho sắc ký pha thường, pha ngược và sắc ký trao đổi ion. Ưu điểm của vi cột sep-pak là làm sạch mẫu triệt để, làm giàu mẫu tốt, tốn ít dung môi và thao tác nhanh, sử dụng thuận tiện. Định tính và định lượng: Việc áp dụng các phương pháp định tính và định lượng của mỗi một độc tố phụ thuộc vào tính chất hoá học của chúng. Với ochratoxin A có thể định tính và định lượng bằng phương pháp sắc ký bản mỏng và sắc ký lỏng cao áp. Phương pháp sắc ký bản mỏng Việc định tính bằng sắc ký bản mỏng có thể tiến hành nhờ vào khả năng phát quang của ochratoxin A dưới đèn cực tím. Giới hạn phát hiện của phương pháp tương đối thấp, đối với ochratoxin A là 0.25ppb. Có thể định lượng ochratoxin A nhờ phương pháp sắc ký bản mỏng bằng cách so sánh cường độ phát quang của mẫu thử so với mẫu chuẩn bằng mắt thường hoặc có thể tiến hành đo trên máy đo mật độ huỳnh quang. Việc đo cường độ phát quang bằng máy là ưu thế hơn xác định bằng mắt vì nó loại trừ được sai số cao được gây ra trong điều kiện của sắc ký bản mỏng. Các nhà khoa học đã xác định được giới hạn chính xác của việc xác định bằng mắt thường là 20- 28% trong điều kiện lý tưởng. [6] Phương pháp sắc ký lỏng cao áp Ngoài sắc ký bản mỏng còn có thể định tính và định lượng ochratoxin A bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp. Sắc ký lỏng cao áp là phương pháp tách xác định các chất dựa trên sự phân bố của chất giữa hai pha: pha tĩnh là chất lỏng bao bọc tạo thành một tấm phim mỏng trên bề mặt một chất rắn trơ (gọi là chất mang) được nhồi vào cột, pha động là dung môi thấm qua toàn bộ bề mặt pha tĩnh. Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp để định tính và định lượng các mycotoxin trong đó có ochratoxin A được tiến hành dựa trên nguyên lý: mẫu được đưa qua bộ phận tiêm mẫu vào dòng dung môi của pha di động được tạo bởi hệ thống phân chia dung môi bao gồm một hay nhiều bơm cao áp chính xác. Dòng chảy của pha di động truyền mẫu vào cột sắc ký có các hạt của pha tĩnh (5- 100 nm). Sau đó dung dịch mẫu được chuyển vào cột. Sự phân tách các thành phần tiến hành ở dạng các dải sắc ký phân tách. Những dải sắc ký này được chiết rút từ cột qua một hay nhiều máy phát hiện. Tín hiệu xung động được khuếch đại và được ghi lại thành đồ thị ở các đỉnh sắc ký. Sắc ký lỏng cao áp là hệ thống thiết bị hoàn thiện với độ xác định chính xác cao đối với việc phân tích các mycotoxin. Giới hạn phát hiện đối với ochratoxin A là 0.5 ng/kg. Trước sự nguy hiểm của ochratoxin A, tổ chức nông lương thế giới (FAO) và tổ chức y tế thế giới (WHO) đã có những chương trình khuyến cáo về phòng chống ochratoxin A trên lương thực, thực phẩm, thức ăn gia súc và đưa ra giới hạn cho phép về mức nhiễm ochratoxin A. Các quốc gia trên thế giới cũng đã đưa ra giới hạn cho phép về mức nhiễm ochratoxin A trên lương thực, thực phẩm và thức ăn gia súc cho quốc gia của mình. Theo FAO và WHO thì giới hạn ochratoxin A trong nông sản thực phẩm là 10 ng/ kg trọng lượng cơ thể/tuần. Năm 2004, cộng đồng châu Âu đã đưa ra tiêu chuẩn giới hạn ochratoxin A là 5ppb trong đất, rễ cà phê và 10ppb trong cà phê chế biến. Tại Việt Nam giới hạn ochratoxin A trong nông sản là 35 ng/ kg [48]. Mức độ nhiễm ochratoxin A đã trở thành một trong những chỉ tiêu xuất khẩu nông sản của các hợp đồng thương mại quốc tế. 1.3.7. Tình hình nghiên cứu phòng chống ochratoxin A trên thế giới và Việt Nam Bên cạnh việc kiểm tra, giám sát mức nhiễm ochratoxin A, việc phòng chống ochratoxin A trên nông sản đã được nhiều quốc gia trên thế giới nghiên cứu. Một số biện pháp được Bộ Nông nghiệp Mỹ và cộng đồng châu Âu khuyến cáo nhằm phòng chống các mycotoxin nói chung và ochratoxin A nói riêng đó là: - Phát triển các cây trồng có khả năng đề kháng nấm - Kiểm soát sự nhiễm các loài nấm sinh độc tố trên cây trồng ở ngoài đồng - Xác định đúng thời gian trước thu hoạch, thu hoạch và sau thu hoạch cho cây trồng - Giảm hàm ẩm của các hạt lương thực sau thu hoạch và trong quá trình bảo quản - Bảo quản các nông sản ở nhiệt độ thấp nếu có thể - Sử dụng các chất diệt nấm và các chất bảo quản để ngăn chặn sự phát triển của nấm mốc - Kiểm soát sự xâm nhiễm của các côn trùng trong bảo quản bằng việc sử dụng các chất diệt côn trùng,… Các nghiên cứu về nguyên nhân nhiễm nấm mốc trong quá trình bảo quản nông sản của nhà khoa học Mỹ Christensen [9] cho thấy, đất là nơi phát sinh đầu tiên của các nấm mốc. Các nấm này đã nhiễm vào rễ của cây rồi nhiễm nội sinh vào cây trồng và từ đó nhiễm tiếp vào bên trong các hạt lương thực. Fernado E. Vega và Francisco, các nhà khoa học của Brazin, Pháp, Mỹ đã phát hiện trong số 11 chủng Penicillium sống nội sinh trong cây cà phê, 4 chủng có khả năng tạo ochratoxin A là P.brevicompactum, P.crustosum, P.olsonii và P.oxalicum [43]. Hiện nay rất nhiều nước trên thế giới quan tâm đến việc phòng chống ochratoxin A. Các nhà khoa học của Brazin, Pháp, Mỹ đã nghiên cứu việc phòng chống nấm mốc Aspergillus ochraceus và Penicillium viridicatum sinh ochratoxin A. Các tác giả Ringot D, Bejaoui H [18] cho thấy chủng A.niger không sinh độc tố đã có khả năng ức chế chủng A.niger, A.ochraceus và các Penicillium sinh độc tố theo cơ chế cạnh tranh. Cộng đồng châu Âu đã công nhận kết quả này và khuyến cáo sử dụng chủng A.niger không sinh độc tố để phòng chống ochratoxin A. Tuy nhiên trong các giải pháp thì giải pháp sinh học được chứng minh là phương pháp hứa hẹn nhất để khử nhiễm ochratoxin A. Bejaui và cộng sự [ 15 ] đã phân lập được 40 chủng Aspergillus thuộc nhóm Aspergillus niger như A.carbonazius, A.niger, A.japonicus từ các quả nho Pháp và đã đánh giá khả năng phân huỷ ochratoxin A trên môi trường canh thang chất chiết nấm men và trên môi trường dịch nho tổng hợp có nhiễm ochratoxin A ở nồng độ 2 mg/l. Kết qủa cho thấy ở cả hai môi trường các nấm này đã có khả năng phân huỷ ochratoxin A thành ochratoxinalpha. Tuy nhiên có sự khác nhau giữa các môi trường được thử. ở môi trường dịch qủa nho và môi trường chất chiết nấm men 77% và 44 % các chủng phân lập đã có khả năng phân huỷ 80 % ochratoxin A . Aspergillus được đánh giá là loài có hiệu quả cao nhất đối với quá trình khử ochratoxin A, tiếp theo là A.japonicus. Varga J và cộng sự [39 ] đã nghiên cứu sự phân huỷ ochratoxin A và các độc tố nấm mốc khác bằng các chủng Rhizopus. Kết quả cho thấy ochratoxin A đã được phân huỷ một cách hiệu quả bằng nấm Rhizopus stolonifer, R.microsporus, R.homothallicus, hai chủng R.oryae và bốn chủng Rhizopus khác chưa được định loại. Các chủng Rhizopus đã phân lập có thể phân huỷ trên 95% ochratoxin A trong vòng 16 ngày. Các chủng A.niger không sinh độc tố và Rhizopus stolonifer cũng đã được cộng đồng châu Âu khuyến cáo để khử nhiễm ochratoxin A trên lương thực nhiễm độc tố này ở mức độ quá giới hạn. Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Đối tƣợng Các mẫu đất và rễ cây cà phê được lấy ở các xã khác nhau của tỉnh ĐắkLắk và ĐắkNông bao gồm: 50 mẫu đất và 30 mẫu rễ cây cà phê. Các mẫu ngô dùng làm cơ chất để kiểm tra khả năng sinh Ochratoxin A của các chủng đã phân lập được lấy ở các cửa hàng bán lẻ thuộc các tỉnh Vĩnh Phúc, Hà Tây. 2.1.2. Môi trƣờng Môi trường thạch khoai tây (PDA) Môi trường Czapek – Dox (g/l) : 2.2. Phƣơng pháp 2.2.1. Phƣơng pháp lấy mẫu cho phân tích độc tố ochratoxin A Tiến hành theo phương pháp của FAO Phương pháp lấy mẫu đất và rễ cây cà phê: Mỗi mẫu lấy khoảng 25g đất và rễ cây cà phê sau đó cho vào túi nilon buộc kín. Phải ghi rõ địa điểm, thời gian lấy mẫu trên mỗi mẫu đất và rễ cà phê. Mẫu được bảo quản trong tủ lạnh trước khi đem phân tích Phương pháp lấy mẫu ngô: Với mỗi mẫu ngô thu nhập ngoài chợ, cửa hàng thì khối hạt ngô được trộn đều lấy 1kg làm đại diện. Một đại diện được trộn đều rồi chia tư, một phần từ đó lại được trộn đều và chia tư lấy 10g làm mẫu phân tích. 2.2.2. Phƣơng pháp phân lập nấm mốc từ đất và rễ cây cà phê Tiến hành theo phương pháp của phòng Vi sinh, Viện Cơ điện Nông nghiệp và Công nghệ Sau thu hoạch. 2.2.2.1. Phương pháp phân lập nấm mốc từ đất trồng cà phê Mẫu đất trồng cà phê được nghiền nhỏ, cân lấy 1g và cho vào ống nghiệm đã có sẵn 9ml nước cất đã thanh trùng ở 121ºC trong 60 phút. Đánh tan và lắc đều bằng máy vovtex. Hút 1 ml dịch trên cho vào ống nghiệm có sẵn 9 ml nước cất đã thanh trùng. Tiến hành pha loãng đến nồng độ thích hợp. Hút 1000ml dịch chứa mẫu đã pha loãng vào hộp Petri đã được sấy khử trùng ở 160ºC trong 2h. Sau đó đổ môi trường PDA lỏng (có bổ sung axit lactic 0.4% để diệt khuẩn) vào hộp petri. Lắc đều hộp petri. Đặt hộp petri trong tủ ấm, nuôi ở 37 ºC trong 5 - 8 ngày. [47] 2.2.2.2.Phương pháp phân lập nấm mốc từ rễ cây cà phê Mẫu rễ cây cà phê được rửa sạch bằng nước cất (rửa 5 lần). Sau đó rửa bằng H 2 O 2 trong 3 phút, tiếp tục rửa bằng javen trong 5 phút. Rửa lại bằng nước từ 5 đến 10 lần. Mẫu rễ cây cà phê sau khi rửa sạch theo cách trên được nghiền nhỏ bằng cối sứ đã lau cồn sạch. Cân 1g mẫu rễ cà phê đã được nghiền nhỏ và cho vào ống nghiệm đã có sẵn 9ml nước cất đã thanh trùng ở 121ºC trong 60 phút. Đánh tan và lắc đều. Hút 1 ml dịch trên cho vào ống nghiệm có sẵn 9 ml nước cất đã thanh trùng. Tiến hành pha loãng đến nồng độ thích hợp. Hút 1000µl dịch chứa mẫu đã pha loãng vào hộp Petri đã được sấy khử trùng ở 160ºC trong 2h. Sau đó đổ môi trường PDA lỏng (có bổ sung axit lactic 0.4% để diệt khuẩn) vào hộp petri. Lắc đều hộp petri. Đặt hộp petri trong tủ ấm, nuôi ở 37 ºC trong 5 - 8 ngày. 2.2.3. Phƣơng pháp làm tiêu bản soi nấm mốc Phương pháp này dùng để phân loại sơ bộ các loài nấm mốc khác nhau dựa trên những đặc điểm hình dạng, kích thước của nấm mốc. [6] Phương pháp : - Nhỏ một giọt dung dịch cồn nước trên lên lam kính. - Lấy nấm mốc trong ống thạch nghiêng bằng que cấy mốc đã được khử trùng và làm nguội. - Rửa tiêu bản bằng dung dịch cồn nước trên. - Nhỏ một giọt xanh metylen lên lam kính, đậy lamen lên, để khô. - Tiến hành soi kính. 2.2.4. Phƣơng pháp phân loại các loài nấm mốc Các bào tử được tạo hỗn dịch trong nước và hỗn dịch này được pha loãng bằng nước cất tinh khiết theo các bậc từ 1: 10. Một ml từ hai hay ba độ pha loãng được chọn, tùy theo mật độ của hỗn dịch ban đầu, được cho vào các hộp petri. Sau đó đun tan chảy thạch, đợi nguội đến gần 45 0 C rồi phân vào các hộp này, sau đó quay vòng hộp petri để trộn đều các bào tử được pha loãng. Để vào tủ ấm 30 0 C, việc phân lập được tiến hành từ những hộp có số lượng khuẩn lạc giới hạn từ 30 đến 100 những khuẩn lạc riêng biệt đồng đều. [6] Để phân loại đến loài của chi Aspergillus, là chi nấm hay gặp nhất, chúng tôi sử dụng tài liệu của Raper và Fennell (The genus Aspergillus). [36] Để phân lập đến loài của chi Penicillium, chúng tôi sử dụng tài liệu của Thom Fennell (The penicillium). [34] 2.2.5. Phƣơng pháp phân tích ochratoxin A Chúng tôi tiến hành phân tích ochratoxin A theo phương pháp của Shimomura và Ishikuro [40]. Phương pháp này gồm các giai đoạn: 2.2.5.1. Chiết xuất Các mẫu ngô được xay nhỏ. 10g ngô đã xay được bổ sung 5ml axit axetic 5% và 50ml cloroform. Mẫu được nghiền bằng máy nghiền đồng thể Polytron trong 5 phút. Lắc dịch nghiền trên trong 30 phút và lọc qua Na 2 SO 4 khan. 25ml dịch lọc được lấy để làm khô ở máy cô chân không quay. Cho 2ml toluen vào chất chiết, sau đó bảo quản ở 4ºC cho đến khi làm sạch. 2.2.5.2. Làm sạch 10ml toluen được cho vào vi cột Sep-pak silica cartridge để rửa cột. 2ml dung dịch mẫu được đưa vào vi cột. Sau đó cột được rửa với 10ml toluen và 6ml clorofom-metanol (97: 3). Ochratoxin A được chiết rút với 10ml toluen- axit axetic (9: 1). Làm khô bằng máy cô chân không quay. Tiến hành định tính và định lượng ochratoxin A theo phương pháp sắc ký bản mỏngvà phương pháp sắc ký lỏng cao áp. Dùng bơm tiêm vi lượng (microsyring) nhỏ trên bản sắc ký lớp mỏng 2 µl, 6 µl và 10 µl mẫu phân tích. Các vết nhỏ của dung dịch được chấm vào bản mỏng cách đường thẳng mép 2 cm (từ mép dưới của bản mỏng) và 1,5- 2 cm từ mỗi cạnh bên. Việc chấm phải thực hiện ở những phần nhỏ sao cho các vết nhỏ không có đường kính quá 5 mm trên đường bắt đầu. Nhỏ 2µl, 6µl, 10 µl chuẩn ochratoxin A trên cùng một bản mỏng. Hệ dung môi dùng cho sắc ký bản mỏng một chiều là: Benzen: axit axetic: methanol (18: 1: 1). Phát hiện ochratoxin A bằng cách phát hiện sự phát quang của bản mỏng ở buồng tối dưới đèn cực tím sóng dài (độ phát xạ cực đại 365 nm). Phát hiện bằng mắt thường trên sắc ký đồ của mẫu chiết cường độ phát quang của các vết có giá trị Rf bằng với chuẩn. Tiến hành so sánh cường độ phát quang của mẫu thử so với mẫu chuẩn bằng mắt thường. 2.2.5.4.Thử xác minh ochratoxin A bằng dung dich NH 3 Vết chấm sắc ký ở mẫu có ochratoxin A sẽ chuyển từ màu xanh lá cây sang màu xanh nước biển khi phun dung dịch NH 3 lên vết chấm sắc ký. 2.2.6. Phƣơng pháp nuôi cấy nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium để kiểm tra khả năng sinh ochratoxin A Cân 25 g ngô (ngô đã được xác định là không có ochratoxin A (theo phương pháp 2.2.5) cho vào bình tam giác, bổ sung 3 ml nước cất, lắc thật đều, khử trùng 1 atm trong 30 phút. Điều chế hỗn dịch của chủng Aspergillus niger và Penicillium để nồng độ đạt 10 9 bào tử/ml là tốt nhất (theo phương pháp pha loãng hàng loạt 2.2.4). Số khuẩn lạc trên ml được tính theo công thức:   dnn C X   21 1,0 Trong đó: C: tổng số khuẩn lạc đếm được trên mỗi hộp Petri giữ lại ở nồng độ có khuẩn lạc từ 30-100. n 1 : số đĩa giữ lại ứng với độ pha loãng đầu. n 2 : số đĩa giữ lại ứng với độ pha loãng thứ 2. d : hệ số pha loãng ứng với độ pha loãng đầu. Lấy 1ml hỗn dịch Aspergillus niger và 1ml hỗn dịch Penicillium nhiễm vào môi trường ngô không có ochratoxin A đã khử trùng, nuôi cấy các chủng Aspergillus niger ở 28- 30 0 C, Penicillium ở 25ºC trong 9 ngày, mỗi ngày lấy ra lắc đều. Tiến hành chiết xuất ochratoxin A từ các mẫu ngô đã nhiễm các chủng Aspegillus niger và Penicillium (theo phương pháp 2.2.5). Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ KIẾN NGHỊ 1. Các mẫu đất và rễ cây cà phê ở Đắclắk, Đắc Nông đã nhiễm các nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A. Mức độ nhiễm là 43.75% (35/80 mẫu phân tích). 2. Mức độ nhiễm nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A ở các địa phương khác nhau là khác nhau. Mức độ nhiễm nấm mốc A.niger và P.viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê ở các tỉnh Đắclắk, Đắc Nông trong khoảng từ 11.1% đến 62.5%. Mức độ nhiễm A.niger và P.viridicatum có khả năng sinh ochratoxin ở huyện Empa cưmgar là cao nhất (62.5%). Mức độ nhiễm nấm mốc A.niger và P.viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A ở huyện Krông ana là thấp nhất (11.1%). 3. Có 15/23 chủng Aspergillus niger đã phân lập từ đất và rễ cây cà phê có khả năng sinh ochratoxin A với hàm lượng dao động từ 0.7- 12ppb. 4. Có 8/12 chủng Penicillium viridicatum đã phân lập từ đất và rễ cây cà phê có khả năng tạo ochratoxin A với hàm lượng dao động từ 0.5-8ppb. KIẾN NGHỊ Kết quả nghiên cứu cho thấy mức độ nhiễm các nấm mốc Aspergillus niger và Penicillium viridicatum có khả năng sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê ở Đắclắk, Đắc Nông là rất cao. Điều này cho thấy cần phải có biện pháp phòng chống ochratoxin A trên cà phê ngay từ giai đoạn ngoài đồng. References Tài liệu Tiếng việt 1. Nguyễn Thuỳ Châu (1996), Nghiên cứu mức độ nhiễm nấm mốc sinh độc tố (mycotoxin) trên ngô, gạo ở Việt Nam và biện pháp phòng trừ, Luận án phó tiến sĩ khoa học sinh học, trường Đại học khoa học tự nhiên, tr. 21- 34, 60- 61. 2. Nguyễn Lân Dũng (1983), Một số sản phẩm của vi nấm, độc tố của vi nấm, Nhà xuất bản Khoa học và kỹ thuật, tr 85- 86. 3. Đậu Ngọc Hào (1986), “ Nghiên cứu phát hiện các độc tố nấm mốc bằng các phương pháp sinh vật học ”, Tạp chí Khoa học và kỹ thuật thú y, tr 9- 14. [...]... 10 AOAC (1990) Official methods of Analysi, Association of official analytical Chemists, Washington 11 Basic-Jukic N (2007) "Renal transplantation in patients with Balkan endemic nephropathy" Transplant Proc 39 (5): 1432–1435 12 Battacone G Nudda A Pulina G (2010) "Effects of Ochratoxin A on Livestock Production" Toxins 2: 1796–1824 13 Belmadani A (1999) "Selective toxicity of ochratoxin A in primary... (2002) "Ochratoxin A concentrations in food and feed from a region with Balkan Endemic Nephropathy" Food additives and contaminants 19 (8): 755–64 8 Al-Anati L, Petzinger E (2006) "Immunotoxic activity of ochratoxin A" J Vet Pharmacol Ther 29 (2): 79–90 9 Aleckovic M (2010) "Glomerular filtration rate in examined population of Bosnian Posavina – region of Balkan Endemic Nephropathy" Bosn J Basic Med Sci... (1969), Ochratoxin A- Occurrence as natural contaminant of a corn sample, Appl, Microbal, pp 765- 766 42 Shotwell, Hesseltine, C.W & Goulden, Vandergraft (1970), Survey of corn for aflatoxin, zearalenone and ochratoxin, Cereal Chem 47 43 Sobolev, V.S (1984), Chemical analytic methods of Trichothecenes, FAO/UNEF/USSR International Training Course “ Training activities on food contamination control and monitoring... rats" National Toxicology Program , May 1989, NTP TR 358 25 Hope JH, Hope BE (2012) "A Review of the Diagnosis and Treatment of Ochratoxin A Inhalational Exposure Associated with Human Illness and Kidney Disease including Focal Segmental Glomerulosclerosis" Journal of Environmental and Public Health 26 J Niemiec, W Borzemska , The effect of Ochratoxin A on egg quality development of embryos and the... Journal of toxicology and environmental health Part B, Critical reviews 9 (3): 265–96 20 De Stefani (1998) "Meat intake, mate drinking and renal cell cancer in Uruguay: a case-control study" Br J Cancer 78 (9): 1239–1243 21 Djukanovic L (2010) "Investigation of Balkan endemic nephropathy in Serbia: how to proceed?" Srp Arh Celok Lek 138: S68-72 22 Doronia,O.D (1992), Thin-layer chromatography in the analysis... egg and tissue of hens and chicks, Journal of Animal and Feed Sciences , 3 , (4) , 309–316, 1994 27 Krogh P (1976) "Experimental porcine nephropathy: changes of renal function and structure peroraly induced by crystalline ochratoxin A" Acta Pathol Microbiol Scand A 84 (5): 429–34 28 Kunio Doi, Koji Uetsuka (2011) "Ochratoxin A induces apoptosis in neuronal cells" International Journal of Molecular Sciences... (1981), Enzyme- Linked Immunosorbent Assay for detection of ochratoxin A, App Envir Microbiol, pp 1472- 1474 33 Pfohl-Leszkowicz A, Manderville RA (2007) "Ochratoxin A: An overview on toxicity and carcinogenicity in animals and humans" Mol Nutr Food Res 51 (1): 61–99 34 Pitt, J.I, Hocking (1985), Methods for Isolation Enumeration and identification Fungi and Food spoilage, Academic press, London, pp 29 -... different brain regions" Arch Toxicol 73 (2): 108–114 14 Bendele AM, (1985) "Ochratoxin A Carcinogenesis in the (C57BL/6J X C3H)F1mouse" J Natl Cancer Inst ;75(4):733-42 15 Blesa J, (2006) "Factors affecting the presence of ochratoxin A in wines" Critical reviews in food science and nutrition 46 (6): 473–8 16 Boonen, Jente; Malysheva, Svetlana V.; Taevernier, Lien; Diana Di Mavungu, José; De Saeger, Sarah;... “ Training activities on food contamination control and monitoring with special reference to mycotoxin”, FAO/UNEP/USSR International Training Course 23 Fink-Gremmels J (2005) "Conclusions from the workshops on Ochratoxin A in Food" Recent developments and significance Organized by ILSI Europe in Baden (Austria), 24 Gary A Boorman "Toxicology and Carcinogenesis studies of Ochratoxin A in F344/N rats"... mycotoxins and volatile organic compounds in mouldy interiors from water-damaged buildings" Journal of Environmental Monitoring 11 : 1849–1858; 2009 36 Rapper, K Fennel (1965), The genus Aspergillus, Williams and Wilkins, Baltimore, Maryland 37 Rashidkhani B (2005) "Major dietary patterns and risk of Renal Cell Carcinoma in a prospective cohort of Swedish women" J.Nutr 135: 1757–1762 38 Richard JL, (1999.) . tiêu Xác định được mức độ nhiễm nấm mốc sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê ở một số vùng trọng điểm trồng cà phê ở Vi t Nam. 1.2.2. Nội dung. Penicillium viridicatum sinh ochratoxin A trong đất và rễ cây cà phê. Phân lập và phân loại chủng nấm mốc A. niger và P.viridicatum trong đất và rễ cây cà phê.