Đang tải... (xem toàn văn)
SKLM là một phương pháp sắc ký dùng chất hấp phụ làm pha tĩnh trải thành lớp mỏng trên tấm kính nhựa hay kim loại. Quá trình tách các hợp chất xảy ra khi cho pha động là dung môi di chuyển qua pha tĩnh. Do đó, SKLM thuộc sắc ký lỏng – rắn.
SẮC KÝ LỚP MỎNG (Thin layer Chromatography) Mục tiêu học Cơ chế SKLM 01 Ứng dụng SKLM nghành dược Pha tĩnh pha động 02 05 04 Các bước tiến hành SKLM 03 sắc ký lớp mỏng Trang Thiết bị dùng SKLM 01 Định nghĩa & Giới thiệu a) o Định Nghĩa SKLM phương pháp sắc ký dùng chất hấp phụ làm pha tĩnh trải thành lớp mỏng kính nhựa hay kim loại Q trình tách hợp chất xảy cho pha động dung môi di chuyển qua pha tĩnh Do đó, SKLM thuộc sắc ký lỏng – rắn b) o Giới Thiệu Năm 1938, Izmailoz & Scharaiber dùng bột oxyd nhôm() mỏng thủy tinh để phân tích dịch chiết alcaloid thực vật o Cơ chế: hấp phụ chiếm phần lớn(có thể phân bố hoặc kết hợp hai) o Pha tĩnh: trương nở theo chiều dọc chiều ngang( chủ yếu Silica gel) o Phương pháp SKLM -Định tính -Phát thành phần hỗn hợp, định tính điểm chỉ -Định lượng (phải có chất chuẩn) hoạt chất thuốc -Theo dõi thành phần chất -Phân lập chất -Thử độ tinh khiết 02 Cơ chế tách SKLM Hấp phụ Phân bố, trao đổi ion Sàng lọc phân tử Rây phân tử Có thể phối hợp đồng thời chế trên, tùy thuộc vào tính chất chất làm pha tĩnh dung môi pha động 03 Pha tĩnh Khái niệm Pha tĩnh chất hấp phụ chọn phù hợp theo yêu cầu phân tích, trải thành lớp mỏng đồng cố định phiến kính hoặc phiến kim loại Silicagel( Kieselgel – gel acid silicic) o o Sử dụng rộng rải Kích thước hạt 10 - 60 µm, diện tích bề mặt 200400 /� o o o Hoạt tính hấp phụ –OH bề mặt định Hàm ẩm tăng làm giảm hoạt độ Hoạt hóa /1 trước sử dụng Nhôm Oxyd o o o o Oxyd nhơm trung tính, acid, base Hoạt tính tùy thuộc lượng nước Hoạt hóa /1 trước sử dụng Theo Brockman: bậc oxyd nhơm Bậc hoạt tính I II III IV V %nước 10 15 o Xác định bậc hoạt tính nhơm oxyd: -Dựa vào màu chuẩn Bậc hoạt tính oxyd nhơm theo Brockman Bậc hoạt tính oxyd nhơm theo Brockman Chất màu Chất màu II II III III IV IV V V Giá trị Aminoazobenzen Aminoazobenzen 0,59 0,59 0,74 0,74 0,85 0,85 0,95 0,95 Sudan đỏ Sudan đỏ 0,00 0,00 0,10 0,10 0,33 0,33 0,56 0,56 Sudan Sudan vàng vàng 0,01 0,25 0,57 0,78 Công thức Khoảng di chuyển chất Hệ số lưu giữ (chỉ có giá trị từ đến cần tách Vận tốc di chuyển chất cần 1) tách Khoảng di chuyển dung mô i Vận tốc di chuyển dung môi hưởng đến Các yếu tố ảnh Chất lượng hoạt tính chất hấp phụ Chiều dày lớp mỏng, quảng đường sắc ký, lượng chất chấm Vị trí số lượng chất cần tách mỏng Thành phần độ tinh khiết pha động Phương pháp khai triển sắc ký Độ bão hịa dung mơi bình sắc ký(hiện tượng “bờ”) Ảnh hưởng cấu tử khác có thành phần hỗn hợp cần tách Độ ẩm, nhiệt độ pH Hiện tượng “bờ” Sử dụng chất đối chiếu Hai chất giống phải có Hai chất phải có lượng chấm triển khai điều kiện sắc ký Sắc ký đồ sắc ký đối chứng Hệ số dung lượng Số đĩa lý thuyết biểu kiến Độ phân giải 08 Các kỹ thuật khai triển TLC Kỹ thuật sắc ký chiều -Dung môi chạy theo chiều từ đầu bảng mỏng lên đầu bảng mỏng Lưu ý vết chấm ban đầu bảng mỏng khơng ngập dung mơi triển khai, mẫu chất bị khuếch tán dung môi làm cho vết bị lem Kỹ thuật sắc ký hai chiều -Trong trường hợp mẫu phân tích có nhiều cấu tử, kỹ thuật sắc ký chiều không đủ tin cậy tiến hành thêm kỹ thuật sắc ký chiều để kết tách rõ ràng - Kỹ thuật SKLM chiều minh họa hình đây: +Dùng loại bảng 20 x 20 +Chấm chất phân tích góc bảng cho vào bình sắc ký chạy hệ dung mơi I, quay góc + Cho vào bình sắc ký chạy hệ dung mơi II dmA dm B Sắc ký đồ SKLM hai chiều vài acid amin Dung môi A: toluen/2-chloroetanol/pyridine Dung môi B:Chloroform/benzyl alcohol/acid acetic Kỹ thuật sắc ký chế hóa -SKLM điều chế cịn gọi kỹ thuật sắc ký chế hóa, thường để tách chất với lượng nhỏ, có xa o Cách tiến hành -Dùng kỹ thuật SKLM chiều, bảng mỏng có kích thước 20 x 20 cm, độ dày chất hấp phụ từ 0,5-1 mm -Hỗn hợp cần tách chấm thành đường liên tục bảng mỏng Sau triển khai hệ dung mơi thích hợp Trường hợp chất hỗn hợp gần nhau, tiến hành triển khai nhiều lần, lần làm phải sấy khô bảng mỏng -Phát vết cách soi đèn tử ngoại hoặc phun thuốc thử lên mé bảng mỏng, tránh phun vùng rộng thuốc thử làm biến đổi cấu trúc cấu tử cần tách để tạo phản ứng màu -Đánh dấu vùng muốn tách mẫu, cạo riêng vùng -Dùng dung mơi thích hợp (có thể dùng dung môi triển khai) để lấy riêng mẫu chất khỏi chất hấp phụ, trình gọi phản hấp phụ 09 Ứng dụng SKLM Định tính thử tinh khiết • • • • Dựa vào Sắc ký so sánh chất thử X với chất đối chiếu A sắc đồ Điều kiện X A: với hệ dung môi khác Chất thử coi tinh khiết sắc ký đồ khơng có vết lạ Bán định lượng định lượng • Tách chiết chất phân tích vết sắc ký dung mơi thích hợp, làm dịch chiết, định lượng kỹ thuật thích hợp: dùng, tốn thời gian • Định lượng trực tiếp mỏng: đo diện tích hay cường độ màu vết sắc ký +Dùng máy đo mật độ quang(Densitometer): chiếu chùm tia vào vết sắc ký đo cường độ hấp thụ hoặc huỳnh quang +Xử lý ảnh với camera kỹ thuật số độ phân giải cao:quét mỏng với hệ thống phân tích thu nhận hình ảnh vết sắc ký Xử lý liệu ảnh máy tính 10 Đánh giá SKLM Ưu điểm - Nhanh, rẻ, thiết bị đơn giản dễ áp dụng so với sắc ký cột cổ điển HPLC( sắc ký lỏng hiệu cao) điều chế - Dễ tìm dung mơi thích hợp để tách hỗn hợp chất - Sử dụng lượng nhỏ dung mơi - Có thể triển khai nhiều lần để thu kết phân tách tốt hơn, có độ tinh khiết cao - Dễ dàng phản hấp phụ để lấy chất cần điều chế khỏi mỏng - Có thể triển khai đồng thời nhiều chất chuẩn điều kiện xác định giúp tạo thuận lợi cho việc xác định hợp chất mong muốn Nhược điểm ● -Các hợp chất bền chấm bề mặt mỏng bị phân hủy tiếp xúc với khơng khí ánh sáng -Trong nhiều trường hợp có xuất đồng thời tạp chất phản hấp phụ để thu hồi chất cần điều chế - Phải chạy nhiều hệ dung môi để phân biệt trường hợp chất có giống hệ dung môi -Tăng giãn rộng vết khuếch tán tốc độ dịng pha động thấp - Trị số có độ lặp lại thấp thành phần pha động thay đổi trình khai triển sắc ký Câu hỏi Ôn tập Thank you for listening ! ... Bình sắc ký Các loại bình sắc ký như: Bình đáy trịn, vng, hình chữ nhật 06 Các bước tiến hành thực SKLM Chuẩn bị mỏng, bình sắc ký thích hợp, pha động Chấm dung dịch lên mỏng: 1-10µg Khai triển sắc. .. Chiều dày lớp mỏng, quảng đường sắc ký, lượng chất chấm Vị trí số lượng chất cần tách mỏng Thành phần độ tinh khiết pha động Phương pháp khai triển sắc ký Độ bão hịa dung mơi bình sắc ký( hiện tượng... sắc ký Sắc ký đồ sắc ký đối chứng Hệ số dung lượng Số đĩa lý thuyết biểu kiến Độ phân giải 08 Các kỹ thuật khai triển TLC Kỹ thuật sắc ký chiều -Dung môi chạy theo chiều từ đầu bảng mỏng